تقسیم بندی باکتری ها از نظر انرژی|گفتار توان گستر 09121623463

تقسیم بندی باکتری ها از نظر انرژی|گفتار توان گستر ۰۹۱۲۱۶۲۳۴۶۳

Photo Autotroph :منبع انرژی نور / منبع کربن :

Chemo Autotroph :منبع انرژی ترکیبات غیرآلی / منبع کربن :

Photo Heterotroph :منبع انرژی نور / منبع کربن : آلی

Chemo Helerotroph : منبع انرژی ترکیبات آلی / منبع کربن :آلی. اکثر باکتری های بیماری زا از این نوع هستند.

انواع محیط های کشت باکتری :

محیط جیره غذایی حداقل : حداقل مواد لازم رشد در محیط کشت وجود دارد.

Selective:  باکتری های خاص درآن رشد می کنند معرف دارد که باکتری را تشخیص دهیم.

Enrichment: محیط کشت باکتری رابا موادی مثل سرم یا … غنی می کنند: معرف ندارد که آیا باکتری مورد نظر ما موجود است یا نه.

فاکتورهای محیطی، دما، اکسیژن – PH ، اسمولاریته محیط:

تقسیم بندی باکتریها براساس نیاز های دمایی :

  • Psychrophils سرما دوست c ۲۰ – ۰         ۱۵= optاپتیمم دمای مناسب
  • Mesophils c ۴۵- ۲۵                 ۳۷= opt   اکثر بیماریزاها
  • Thermophils                      ۷۰- ۴۵                    ۵۵= opt
  • Extrene thermophols ۹۷- ۴۵               ۹۰opt =

بر اساس نیاز به اکسیژن باکتریها به گروههای زیر تقسیم می شوند.:

Anaerobes Obligate : باکتریهای بی هوازی اجباری.  بدون نیاز به  تنها در شرایطی رشد می کنند که اکسیژن از محیط خارج شود.

 Obligate Aerobes: باکتریهای هوازی اجباری. در شرایطی رشد می کنند که اکسیژن در محیط  باشد.زنجیره تنفسی انتقال الکترون در انها کامل است. نیاز به

Micro aerophilic: نیاز کم به  باکتریهای هستند که بهترین وضعیت رشد آنها در فشار کم اکسیژن است و اگر فشار اکسیژن بالا باشد قادر به رشد نیستند.

Aerotolerant anaerobes: باکتریهای بی هوازی مقاوم در برابر هوا که وجود اکسیژن را تحمل می کنند. اگر در معرض آن قرارگیرند کشته نمی شوند.

Facultative  anaerobes: باکتریهای بی هوازی اختیاری که در حضور یا غیاب اکسیژن می توانند رشد کنند و بسته به شرایط، زندگی هوازی یا بی هوازی دارند.

ازلحاظ نیاز به PH :

اپتیمم  PH ( PH مناسب) برابر است با ۵/۶- ۵/۷ براین اساس باکتری ها را به سه دسته:  Neutrophilic(خنثی دوست)  Alkalophilic, (قلیا دوست)،  Acido philic(اسید دوست) تقسیم می کنند.

از لحاظ شرایط اسمولاریته باکتریها به ۵ دسته تقسیم می شوند :

  • Halophilic نمک دوست
  • Extreme halophilic به شدت نمک دوست
  • Non halophilic بدون نمک (نمک نا دوست)
  • Osmophilic شرایط اسمولاریته بالا چه نمکی چه قندی
  • Xerophilic  اسمولاریته خاص و اندک

تغذیه و متابولیسم درباکتری ها :

درباکتری ها همانند سایر موجودات زنده عناصر مختلفی شامل اکسیژن، هیدروژن، نیتروژن، کربن ، و فسفر مورد نیاز است که این ترکیبات دربرخی باکتری ها بصورت ترکیبات معدنی و دربعضی ترکیبات آلی مورد استفاده قرار می گیرد. در دنیایی میکروبی تنوع بسیار زیادی وجود دارد و باکتری ها توانایی استفاده از منابع مختلف آلی و معدنی این عناصر را دارند. برخی از باکتری ها که بعضاً باکتری های مفیدی هستند می توانند از ۱۰۰ نوع منبع مختلف بعنوان منبع کربن استفاده کنند و از  می توانند بعنوان اکسیده ترین شکل کربن با ظرفیت استفاده کنند و برای این که بتوانند از کربن  استفاده کنند و عمل اتوتروفی را انجام دهند باید با صرف انرژی ، کربن را احیا کنند بطوری که عمده اکسیداسیون احیای کربن به عدد اکسیداسیون احیا ترکیبات آلی برسد کربن بصورت ، CO ،  (متان) بصورت ترکیبات آلی کربن (  ) وجود دارد.

در co ظرفیت کربن ۲+ ، متان ۴- که متان احیا شده ترین شکل کربن است در ترکیبات آلی مثل  (گلوکز) ظرفیت کربن ۴- است.

قند های مختلف، اشکال مختلف احیا شده کربن هستند. هیدروکربن های مختلف که بعنوان فراورده های نفتی استفاده می کنیم ، ترکیبات آلی کربن دار هستند که حاوی کربن احیا شده اند که آن ها را با  ترکیب کرده و می سوزانیم. باکتری ها برعکس موجودات آلی توانایی استفاده از  را که اکسیدترین شکل کربن است را دارند. برای این که کربن  مورد استفاده قرار بگیرد باید بصورت احیا شده در بیاید و به ۴- برسد. به همین دلیل تعداد خاصی از موجودات و تعدادی که عمل فتوسنتز را انجام می دهند، هم چنین باکتری های اتوتروف بخصوص کمواتوتروف یا شیمیواتوتروف که در غیاب نورهم رشد می کنند می توانند با استفاده از انرژی خورشید (از فوتون های نوری) و همین طور انرژی حاصل از اکسیداسیون ترکیبات معدنی احیا شده مثل ،  گوگرد،  را احیا کنند و آن را به ترکیبات آلی احیا شده کربن دارتبدیل کنند مثل گلوکز ، متان.

باکتری هایی که در دامپزشکی مهم هستند باکتری هایی هستند که از ترکیبات آلی کربن دار استفاده می کنند. مثل گلوکز،لاکتوز، ساکارز.

باکتری هایی درمحیط هستند که از ترکیبات غیرمتعارف کربن دار -از نظر ما- استفاده می کنند (منابع نفتی و هیدروکربن ها، مواد پلاستیکی،ضایعات پلاستیکی) این باکتریها از نظر اکولوژی برای تجزیه زباله ها و پاکسازی محیط ازاین زباله ها اهمیت دارند یا برای پاکسازی نفت و فراورده های نفتی و نشت نفت از کشتی ها به آب دریاها استفاده می کنند.

باکتری ها علاوه براینکه می توانند از ترکیبات اکسیدشده و احیا شده کربن بعنوان منبع آن استفاده کنند.خیلی باکتری ها ازکربن ساختمان اسیدهای آمینه و پروتئین ها استفاده می کنند باکتری های سخت رشد (کلیستریدیوم) ازتخمیر اسیدهای آمینه در شرایط بی هوازی برای تولید انرژی و تأمین منبع کربن استفاده می کنند.

برای رشد برخی از باکتری ها لازم است مثل بروسلاآبورتوس Brucella abortus (عامل تب مالت)  و یا campylobacter fetus subsp fetus که برای رشد نیاز به  دارند. دراین مواقع  برای سنتز کوآنزیم ها و اسیدهای آمینه و برخی ویتامین ها تثبیت می شود بطوری که درکشت های اولیه اگر  درمحیط نباشد باکتری هایی مثل بروسلاآبورتوس قادر  به رشد نیستند.

عنصردیگر که مورد نیاز باکتری هاست ازت یا N است که بصورت نیتروژن مولکولی  قسمت اعظم جو را تشکیل می دهد . عنصر  با ظرفیت ۰ یک عنصر بسیار پایدار است سه پیوند محکم کووالانسی بین دو N  وجود دارد که گسستن این پیوندها و وارد کردن N در فعالیت های شیمیایی بسیار مشکل است .

اما N عنصری است که جز عناصر ضروری یاخته هاست . N  به اشکال مختلفی دیده می شود عمده آن در جو است بعلاوه برآن ازت بصورت نیتریت  ، نیترات  ،  آمونیاک، آمونیوم، ترکیبات آلی نیتروژن دارد اسید آمینه، پروتئین ها دیده می شود. ازت برای اینکه مورد استفاده قرار گیرد، باید عدد اکسیداسیون احیا آن به عدد اکسیداسیون احیا ترکیبات آلی ازت دار برسد.

در ترکیبات آلی ازت دار N را بصورت  داریم که ۲- است و همین طور  که ۲- است . باکتری برای این که بتواند N را وارد ساختارهای یاخته ای که باید از ترکیبات ازت دار (aa, Pr) استفاده کند.

در باکتری های دامپزشکی و پزشکی بیماری زا محیط های کشت غالبا حاوی pepton(عصاره گوشت) یا تخم مرغ است که این مواد و ترکیبات ازت دار را بصورت  و پروتئین ها در اختیار این باکتری ها قرار می دهد .درمحیط سیمون سیترات منبع ازت کلرید آمونیوم است.   یک ترکیب معدنی هرچند احیا شده است اما تعداد خاصی از باکتریها می توانند از CL  استفاده کنند و آن را تبدیل به  کنند ازجمله این باکتری ها؛ سالمونلا است که در آزمایش سیترات ،مثبت و  Ecoli سیترات منفی است و قابلیت رشد دراین محیط را ندارد.

باکتری های دیگر که عمدتاً محیطی هستند و درخاک زندگی می کنند از سایر منابع N و ازت بعنوان منبع N مجبور هستند استفاده کنند. استفاده از  کارساده ای نیست. به همین دلیل تعداد بسیار خاصی از باکتری ها توانایی استفاده از  جو یا هوا را بعنوان ازت دارند. این باکتری ها معمولاً هم زیستی مفیدی با بعضی گیاهان انجام می دهند.در ریشه گیاهان تیره حبوبات مثل سویا، لوبیا، عدس، یونجه، شبدر، نخود یک همزیستی مفیدی بین باکتری های خاک مثل برخی ازتوباکترها، باسیلوس ها، ریزوبیوم ها وجود دارد که ژنوم این باکتری ها در ژنوم ریشه گیاه آمیخته می شود. بصورت طبیعی انتقال ژن انجام می شود و ژنوم ترانسفورمه شده وتغییر یافته ای ازاین انتقال ژن بوجود می آید و باعث ایجاد غده یا گره در ریشه می شود (تکثیر سلولی و افزایش میتوز) و این گره ها و ریشه ها محلی هستند برای تثبیت N هوا، که به این باکتری های بسیار مفید خدمت بزرگی را به انسان ها می کند و  را با تصرف ATP همین طور با استفاده از الکترون های ناشی از ترکیبات احیا شده مثل NADH احیا می کنند و نیتروژن را از صفر احیا می کنند به سطح ۲-  .

آمونیوم یا  یک ترکیب احیا شده است اما ترکیبی است که قابل استفاده نیست ،ماده سمی است هم برای انسان هم باکتری ها :

 

آمونیوم بطور مستقیم قابل استفاده نیست به همین دلیل باکتری ها باید این عامل را به نحوی با برخی ترکیبات موجود در یاخته ترکیب کنند تا بتوانند ازآن بعنوان ترکیب آلی نیتروژن در استفاده کنند. به این ترتیب که این باکتری ها  را با اسید آلفاکتوگلوتاریک (ماده واسط چرخه کربس) ترکیب می کنند که اسید گلوتامیک ایجاد می شود یا  احیا شده با اسید آسپارتیک ترکیب می شود و تولید آسپارژین را می کند.

اسید گلوتاتیک  اسید آلفاکتوگلوتاریک +

اسید اسپارژین  اسید آسپارتیک +  احیا شده

گلوتامیک و آسپارژین و ترکیبات یاخته ای ازت دار حاصل از این ترکیبات پیش ساز اسید های آمینه هستند.بنابراین بااین فرآیند ها نیتروژن وارد ساختارهای اسیدهای آمینه و پروتئین ها و ترکیبات یاخته ای می شود و نیاز باکتری برطرف می شود.

از طریق گره ها و غده های موجود در ریشه ها ازماده فراوان و کم ارزش  یا نتیروژن ، سالیانه حدود  تا  تن از ماده آمونیاک (  ) تولید می کنند. به همین دلیل پروتئینی که در حبوبات داریم بسیار بیشتر از غلات است. این پدیده مهم را تثبیت نیتروژن (Nitrogen fixation) می گویند.به همین خاطر از سویا بعنوان جایگزین گوشت یا ترکیب پروتئینی گیاهی استفاده می کنند. این عمل تثبیت نیتروژن خاص بعضی باکتری هاست. آلودگی خاک می تواند درچرخه نیتروژن اثر گذار باشد. باکتری ها می توانند از نیتریت و نیترات استفاده کند (شکل اکسیده شده نیتروژن) نیترات و نتیریت برای اینکه احیا و جذب شود و درساختمان های اسیدهای آمینه قرار گیرد باید احیا شود . عمل احیایی این دو ماده با آنزیم های خاصی انجام می شود بنام نیترات ردوکتاز و نیتریت وردوکتاز.

ازنیترات معمولاً بعنوان کود شیمیایی در کشاورزی استفاده می شود مثل نیترات پتاسیم که درخاک توسط  باکتری ها مورد استفاده قرار می گیردتا احیا شود و وارد بیوسنتز اسیدهای آمینه گردد. اما اگر میزان نیترات بیش ازاندازه باشد به صورت نیترات درآب و درگیاه تجمع پیدا می کند. می تواند درانسان وحیواناتی که در این آب هستند وازآن استفاده می کنند مسمومیت با نیترات ایجاد کند. یکی از فاکتورهای مواد غذایی که باید اندازه گیری شود نیترات است. برخی گیاهان نیترات را درخود جمع می کنند مثل تاج خروس که بعنوان گیاه زینتی استفاده می شود اگر در تغذیه دام استفاده شود در گاو مسمومیت ناشی ازنتیرات ایجاد میکند.

 

 

(۵+)           (۵+)                                                                        (۳-)            (۳+)

عنصر بعدی گوگرد (سولفور S ) است که به اشکال مختلف در طبیعت وجود دارد (هم اکسیده و هم احیا) ترکیبات آلی گوگرد به صورت R-SH است بصورت عوامل سولفیدریل در ترکیبات آلی دیده می شود بخصوص در اسیدهای آمینه مثل میتونین، سیستئین، پل ارتباطی بین Pr ها ، هموگلوبین ها، پادتن ها ، عدد اکسیداسیون احیا در R-SH ۲ – است . ترکیب دیگر گوگرد دار   است ( سولفید هیدروژن) .

ازترکیبات دیگر گوگرد دار( S) است که احیاست. ترکیبات اکسید شده هم وجود دارد مثل تیوسولفات مثل سولفات  (۳+) . باکتری ها برای تأمین سولفید مثل نیتروژن ازترکیبات معدنی و آلی سولفور می توانند استفاده کنند. اکثر باکتری ها در دامپزشکی و پزشکی از ترکیبات آلی گوگرد استفاده می کنند مثل pepton و عصاره گوشت، گاهی بطور اختصاصی به محیط ها –L سیستئین، تیوگلوتامات برای تأمین گوگرد باکتری اضافه می کنیم. باکتری هایی که درمحیط هستند ( خاک معدن، مرداب ها، چشمه ها، از گوگرد های اکسید شده استفاده می کنند بعضاً ازسولفات (اکسیده ترین شکل S) یا خود گوگرد یا از  (ماده احیا شده گوگرد که خطرناک و سمی است ، گازی که در فاضلاب توسط باکتری ها از تجزیه اسید آمینه ایجاد می شود و باعث خفگی چاه کن ها می شود این ترکیب می تواند اکسیده شود و ازاکسیداز گوگرد آزاد شود و انرژی تولید شود)

به همین دلیل درمورد عناصری مثل کربن، گوگرد، نیتروژن ، آهن ، چرخه هایی وجود دارد به نام چرخه های زیستی زمینی شیمیایی Biogeochemical اکسیداسیون واحیای این ترکیبات در جو ، آب، بدن، گیاه و جانور است که بعضاً بوسیله باکتری ها انجام می شود هر اختلال دراین چرخه ها می توانند میزان این عناصر را درطبیعت کاهش یا افزایش دهد.

یکی دیگر ازعناصر آهن است (Fe) به دو فرم در طبیعت دیده می شود آهن احیا شده (فرو  ) ، آهن اکسید شده (فروس ) آهن دربسیاری از موجودات از جمله باکتری ها درترکیبات ناقل و حامل الکترون و اکسیژن دخالت می کند مثل پروتئین هایی که به آنها هِم Heme گفته می شود. نوع غیرهِمی و غیرخونی هم هستند. ازجمله این ترکیبات پروتئین های سیتوکروم است که درانتقال الکترون نقش دارند و به همین دلیل آهن باید در مواد غذایی وجود داشته باشد میزان نیاز به آهن کم است و معمولاً همراه با سایر ترکیبات غذایی در اختیار باکتری ها قرار می گیرد. دربدن موجودات همین طور محیط باکتری ها پروتئین هایی هستند که آهن را از محیط بدن و میزبان یا محیط زندگی جذب می کنند و دریافت می کنند و در پیکرآن جانور با باکتری واکنش می دهد. در باکتری های مختلف پروتئین های مختلفی را شناسایی کرده اند که پذیرندهFe هستند این پروتئین ها را اصطلاحاً sidro phore  یا سیدروفور یا سیتوکروم می نامند، در باکتری های مختلف اسامی مختلفی دارد و یکی از عوامل مهم بیماری زائی وحدت درباکتری های بیماریزا هستند مثلاً در باکتری مایکو باکتریوم توبرکلوسیس (عامل بیماری سل) درانسان پروتئین که نقش پذیرنده Fe را دارد سیدروفوری است که به آن Mycobactin می گویند یا در باکتری خانواده آنتروباکتریاسه مثل E coli پروتئینی که وجود دارد و به Fe متصل می شود اصطلاحاً Enterobactin  می نامند.

این پروتئین های سیتوکروم توسط ژن های خاصی در باکتری های بیماری زا رمز می شود و به همین دلیل یکی از روش های تعیین بیماری زائی باکتری ها در روش های مولکولی تعیین حضور یاعدم حضور ژن های رمز کننده ی این پروتئین هاست.

حتی وجود میزان زیاد Fe دربرخی مواد غذایی مثلاً تخم مرغ یا در مواد غذایی سیلو شده که در دامداری ها استفاده می شود باعث می شود برخی از باکتری هایی که نیاز به آهن دارند رشد بهتری داشته باشند . باکتری هایی مثل کمپیلوباکتر campylobacter، لیستریا listeria، نیاز به Fe دارند.

عوامل رشد :

دررابطه با عوامل رشد دو اصطلاح داریم :

  • Protrophy: درمواقعی مورد استفاده قرار می گیرد که باکتری از مواد ساده ای که در اختیارش است مواد مورد نیازش را سنتز می کند، خودکفاست، نیاز به ترکیبات اضافی ندارد معمولاً سویه های وحشیwild strain حالت پروتروفی دارند اما اگر دچار موتاسیون شوند چه طبیعی و چه مصنوعی (روش های ژنتیکی) و دراثر آن به یک ماده نیازمند شود بطوری که درغیاب این ماده نتواند رشد کند این حالت را Auxotrophy می گویند.
  • Auxotrophy: این سویه های Auxotrophy سویه موتانت و سویه هایی هستند که توانایی رشد زیادی ندارند. بخصوص در بدن انسان ها و حیوانات نمی توانند بیش از چند نسل تولید مثل کنند . سویه های AUXOTROPH  هستند که به ترکیبات آروماتیک نیاز پیدا می کنند مثل PABA، اسید فولیک، نیاسین، ،  ، اراشیدونیک اسید، سویه های وحشی این ترکیبات را می سازند. این سویه های Auxotroph که نیازمند می شوند Growth منفی یا His  هیستیدین منفی می نامند که هیستیدین را نمی تواند بسازد این سویه های نقصان را معمولاً برای ساختن واکسن بکار می روند.

جدول صفحه ۲۶۴ کتاب : جدولی وجود دارد که در واقع نیازهای غذایی باکتری ها را نوشته است . آب و املاح مختلف (سولفات آهن ) این ترکیبات مشترک است.

درمحیط شماره ۱ علاوه بر املاح کلرید آمونیوم را داریم شبیه سیمون سیترات است که سیترات ندارد باکتری هایی می توانند رشد کنند که از  هوا می توانند استفاده کنند پروتروف هستند که منبع کربن  هوا است. بنابراین ، این باکتری ها بسیار دور ازموجودات آلی هستند. در اعماق معادن در تاریکی می توانند رشد کنند، باکتری های  سنگخوار، صخره خوار و …

محیط ۲ علاوه بر ترکیبات قبلی ، گلوکز دارد. برای باکتری هایی که بتوانند ازکلرید آمونیوم و گلوکز ترکیبات خود را بسازند استقلال زیادی دارند پروتروفی کامل دارند.

محیط ۳ علاوه بر گلوکز و کلرید آمونیوم ، حاوی نیاسین یا اسید نیکوتینیک است که یک نوع ویتامین وکوآنزیم است . باکتری نیاز به ویتامین دارد. حالت پروتوفی کمتر می شود ولی باز با اضافه کردن نیاسین می تواند رشد کند.

محیط ۴ گلوکز دار، همراه با عصاره مخمر، عصاره گوشت یا pepton، وقتی مقادیرمحیط مشخص باشد این نوع محیط ها را سنتیک می نامند یا دست ساز که اجزا مشخص اند. در عصاره گوشت یا pepton میزان اجزا مشخص نیست این محیط ها را پیچیده یا complex می نامند اکثر باکتری ها می توانند دراین محیط رشد کنند به همین دلیل در اکثر محیط ها یک محیط پیچیده درست می کنیم. عصاره شیر، مخمر، گوشت، …چون خواص باکتری را نمی دانیم . قطعاً فشار اسمزی درمحیط مشخص است. یکی از دلایل رشد نکردن باکتری در عسل ,سفت بودن و میزان قند بالا و میزان مواد ضد میکروبی است. PH مسئله بعدی است. در اکثر محیط ها تامپونی هم وجود دارد چون هم اسیدی و هم قلیایی می شود برای کنترل PH محیط مثل کربنات ها و فسفات ها  دی هیدروژن مونوپتاسیک استفاده می شود. تامپون های قلیایی درشرایط اسیدی به محیط اضافه می شودو برعکس  تامپونهای اسیدی  در شرایط قلیایی وارد محیط می شود.

 

فصل هفتم : فیزیولوژی باکتری ها :

باکتری ها بعد ازاین که غذای مناسبی دراختیارشان قرارگرفت، رشد کرده و تقسیم می شوند (تقسیم دوتایی) به این ترتیب که به اندازه مشخص رسید از وسط به دو قسمت تقسیم می شود و یاخته های دختر و نسل های بعدی ایجاد می شود چه به صورت کوکسی و چه باسیل اندازه مشخص و ثابتی دارند وقتی به این اندازه رسیدند تقسیم می شوند و در کوکسی ها در جهات مختلفی تقسیم می شوند.

رشد باکتری افزایش در همه ترکیبات است به حدی که درمرحله تقسیم قرار گیرد. بزرگ شدن مجازی باکتری مثل جذب آب (تورژسانس) رشد واقعی نیست. با رشد تصاعدی باکتری توده ای در محیط ایجاد می شود که نشان دهنده تقسیم همه جانبه باکتری است . این توده را بیوماس biomass (توده زیستی) می نامند. این توده معرف جمعیت میکربی است که برای محاسبه آن می توان روش های مختلفی استفاده کرد. یکی از روش های concentration cell که بوسیله دستگاه های خاصی انجام می شود که امپدانس (Impedance) است. در روش های اتوماتیک دستگاه براساس رشد باکتری و تجزیه ماکرومولکول های که لازمه رشد باکتری هستند توده بیولوژی را تعیین می کند به این ترتیب که از تجزیه ماکرومولکول های محیط (چربی ها، پروتئین ها …) توسط باکتری مولکول های کوچکتر باردار یا یون دار تولید می شود.ایجاد این ترکیبات کوچک و باردار باعث می شود جریان الکتریکی راحت تر از این ماده غذایی عبور می کند . جریان الکترونی افزایش می یابد و مقاومت محیط کاهش پیدا می کند . کاهش مقاومت محیط وافزایش فرکانس نشانه رشد باکتری است که بوسیله دستگاه اندازه گیری می شود که به آن Impedance می گویند.که در دستگاه های خودکار بیومس استفاده می شود.

راه دیگر تعیین بیومس اندازه گیری C,N است که در روش های بیوشیمیایی استفاده می شود اما در میکروبیولوژی برای تعیین Biomass از شمارش باکتری ها استفاده می کنیم. برای شمارش باکتری ها روش های مختلفی وجود دارد. در Biomass هم باکتری ها مرده و هم زنده را می توانیم شمارش کنیم. شمارش باکتری ها در آزمایشات اهمیت زیادی دارد  .درآزمایشاتی که به صورت Invitro در آزمایشگاه یا Invivo در حد موجودات آزمایشگاهی اهمیت دارد . درمورد واکسن تعداد مشخص و استانداردی باکتری و جرم باید داخل واکسن باشد. اگر یاخته کم باشد ایمنی ایجاد نمی کند، اگر بیشتر باشد باعث ایجاد بیماری می شود. واکسن های زنده مثل بروسلا،  درمورد واکسن های زهرابه میزان استفاده از توکسین باید استاندارد باشد . هرفراورده بیولوژیک باید استاندارد باشد. درمورد باکتری باید شمارش را برای استاندارد کردن آزمایش و فراورده تولیدی باید داشته باشیم برای Total count (شمارش کامل) از لام های هماتولوژی استفاده می شود.لام نئوبار که برای شمارش WBC,RBC استفاده می شود.

روش دیگر استفاده از روش کدورت سنجی (Tubidity) است . هرچه میزان باکتری بیشتر، محیط غلیظ تر و Biomass بیشتر است هرچه باکتری کمتر و Biomass کمتر باشد کدورت کمتر است می توان از اسپکتروفتومتری برای اندازه گیری کدورت استفاده کنیم (محاسبه OD)

روش کدورت سنجی : باکتری در محیطی رشد می کند دراثر رشد باعث بروز کدورت درمحیط کشت می شود. این کدورت که میزانش ارتباط مستقیمی با تعداد باکتری دارد به روش های مختلفی مورد سه بخش قرار می گیرد :

۱- اندازه گیری OD یا Optical Density بوسیله اسپکتروفتومتری در طول موج خاصی (حدود nm ۶۰۰) انجام می شود. بعد ازصفرکردن یا بلانک کدورت توسط نور وارده و خارج شده محاسبه می گردد. کدورت هرچه بیشتر باشد ، جذب نوری بالاتر است و میزان باکتری بالاتر است ، log جذب نوری را مطابق جدولی  تعیین می کند.

۲- کدورت سنجی با چشم: می توانیم با داشتن استاندارد مشخص و چشم کدورت ایجاد شده را تاحدودی تخمین بزنیم استانداردرا اصطلاحاً Mc Farland Nephelometic standard می گویند . ازترکیب یک اسید و نمک ایجاد می شود و برای تهیه آن یازده لوله را تهیه می کنیم.

۱۰ ۹ ۸ ۷ ۶ ۵ ۴ ۳ ۲ ۱ ۵/۰ شماره لوله
۹ ۱/۹ ۲/۹ ۳/۹ ۴/۹ ۵/۹ ۶/۹ ۷/۹ ۸/۹ ۹/۹ ۹۵/۹ اسید سولفوریک ۱% به میلی لیتر
۱ ۹/۰ ۸/۰ ۷/۰ ۶/۰ ۵/۰ ۴/۰ ۳/۰ ۲/۰ ۱/۰ ۰۵/۰ محلول ۱% کلرید باریم به میلی لیتر
کدورت افزایش می یابد

 

به مقداری می ریزیم که حجم هرلوله با اسید ۱۰ cc شود.

هرچه کلرید باریم بیشتر باشد کدورت بیشتر می شود : ۵/۰ شفاف ترین و آخرین لوله کدرترین لوله است . کدورت هرکدام ازاین لوله ها؛ معادل کدورتی است که تعداد مشخصی باکتری در هر cc می تواند ایجاد کند.

تعداد باکتری :

۳۰۰۰           ۰۰۰       ۱۲۰۰          ۹۰۰  ۶۰۰        ۳۰۰         ۱۵۰

لوله نمونه را درکنار این لوله ها قرار می دهیم (این لوله ها را سال ها می توانیم استفاده کنیم) وکدورت برابر با لوله نمونه را پیدا کرده و تعداد باکتری بدست می آید. روش ساده ای است اما شمارش انجام شده تقریبی است و نوعی Total count باکتری های مرده و زنده را محاسبه می کند.

اما بعضی مواقع لازم است تعداد باکتری های زنده را مشخص کنیم. مثل انجام بیماریزایی باکتری ، در واکسن های زنده تغییر حدت یافته، تعداد باکتری های موجود در واکسن را پیدا کنیم . دراین مواقع از روش کشت استفاده می کنیم:

۳-کشت :برای شمارش باکتری های زنده از سوسپانسیون رقت تهیه کرده و کشت داده ، پرگنه ها را شمارش می کنیم درهرروش کمی باید رقت سازی کنیم یا غلظت سازی مثل mic

۹/۰          ۹/۰          ۹/۰             ۹/۰              ۹/۰        سرم فیزیولوژی

۱/۰ دور ریخته می شود        ۱/۰         ۱/۰           ۱/۰           ۱/۰          ۱/۰              تعلیق باکتری

لوله پنجم    لوله چهارم   لوله سوم   لوله دوم   لوله اول

رقت سازی سریالی را انجام می دهیم که خواهیم داشت :

: رقت

۱ سی سی از این غلظت ها را در پلیت کشت می دهیم و اگر لوله نمونه غلیظ باشد بیشتر رقیق می کنیم و داخل پلت کشت می دهیم.

تعداد باکتری درنمونه celony forming unit CFU = عکس رقت ضربدر تعداد باکتری.                مثلاً ۲۰۰ باکتری در رقت  داریم تعداد باکتری می شود دوملیون باکتری.

باکتری دراین نمونه (زنده)=   × ۲= ×۰۰ ۲

این تعداد باکتری درآزمایشات بخصوص بیماریزایی باید مشخص باشد. براساس استاندارد انجام شود.

منحنی رشد :

وقتی باکتری را درمحیطی کشت می دهیم همانند رشد سایر موجودات، رشد باکتری دارای سلسله مراتبی هست به نحوی که می توانیم این نحوه رشد را روی منحنی رسم کنیم. درمورد باکتری ها هم همانند سایر موجودات می توانیم مراحل رشد را ترسیم کنیم و هرمرحله دارای مشخصات خود است. محور افقی زمان و محور عمودی log رشد را نشان می دهد. باکتری را ازنمونه در محیط کشت ها ، کشت می دهیم. ابتدای منحنی رشد که زمان منتقل کردن باکتری است مرحله adaptation است که خود را منطبق می کند تا رشد کند یا lag phae شود و وقتی به شرایط عادت پیدا کرد شروع به رشد سریع می کند.

زمان رشد بستگی به عوامل مختلفی دارد : می تواند طولانی یا کوتاه باشد به عنوان مثال اگر باکتری را از محیطی به محیط دیگر منتقل کنیم که مشابه مرحله اول است مرحله Adaptation کوتاه شده و نیاز به آنزیم های جدید ندارد و lag phase کوتاه است .

بعدازاین مرحله باکتری بطور لگاریتمی شروع به تکثیر و ازدیاد می کند این مرحله را مرحله رشد تصاعدی Exponential phase یا رشد لگاریتمی می نامند. باکتری دراین مرحله با حداکثر توان شروع به رشد می کند و تقسیم دوتایی این زمان دو برابر شدن را اصطلاحاً generation time یا زمان تزاید یا تکثیرو یا زمان دوبرابر شدن می نامند. این زمان در باکتری های مختلف متفاوت است و بستگی به جنس و گونه باکتری دارد.

جدول ۲۹۳ کتاب که زمان تزاید بعضی باکتری ها نوشته شده مثلاً درمورد باسیلوس ترموفیلوس ۵/۸ دقیقه است . درمورد E.coli زمان تزاید ۲۰ دقیقه است . E.coli  یک باکتری سریع الرشد می دانیم یعنی این تزاید رشد و زمان تزاید را می توان لمس کرد بطوری که پرگنه های Ecoli را درعرض چند ساعت می توانیم ببینیم. باکتری های مثل مایکوباکتریوم توبرکلوسیس زمان تزایدشان حدود ۶ ساعت است بنابراین اگر Ecoli را ۴۸ ساعت درزمان رشد لگاریتمی نگه داریم درمورد Ecoli  ۴ هزار برابر کره زمین پرگنه خواهیم داشت. درمورد مایکوباکتریوم باید ۴۰ روز صبرکنیم تا پرگنه های این باکتری را ببینیم.زمان تزاید تا این حد مهم است. نیتروباکترآژیلیس زمان تزایدش ۲۰ ساعت است که می توانیم درطول یک سال یکبار ببینیم. اما مرحله رشد لگاریتمی با توجه به مثال ذکر شده درمورد باکتری های سریع الرشد کوتاه است. Ecoli سریع این مرحله را طی می کند چون مواد غذایی کاهش می یابد.

دراین مرحله بواسطه متابولیسم، موادسمی آزاد می شود و PH محیط تغییر می کند. اسمولاریته محیط نیزتغییر می کند همه این فاکتورها باعث می شود جلوی رشد باکتری گرفته شود و باکتری درزمان کوتاهی درمرحله رشد لگاریتمی بماند. بنابراین باکتری ها با حداکثر سرعت رشد می کنند از مواد غذایی استفاده می کنند. اگردراین مرحله وارد بدن شوند بیماری را ایجاد می کنند.

دراین مرحله از رشد برخی آنتی بیوتیک ها مثل پنی سیلین روی باکتری می تواند اثر کند. ازطرفی باکتریها در این زمان حساس تر هم هستند. به همین دلیل در آزمایشات باید از کشت تازه و جوان استفاده کنیم از کشت های کهنه  نباید استفاده کنیم.

بعداز مرحله رشد لگاریتمی براثر شرایط حاکم منحنی مسیر افقی پیدا می کند که این مرحله را اصطلاحاً مرحله رکود می نامند (Stationary phase). مرحله ای بین زندگی و مرگ که میزان سموم افزایش، مواد غذایی کاهش، شرایط محیطی نامناسب است و سرعت رشد کاهش می یابد بعضی باکتری ها دراین شرایط ازبین می روند و پیکرشان تجزیه می شود ، موادی آزاد می شود که سایرین می توانند ازآن ها استفاده کنند.

این زمان نهایتاً به مرحله بعدی یا مرحله مرگ یا Death phase می رسد، مرحله مرگ Death هم همانند مرحله صعودی حالت لگاریتمی دارد و ازتعداد باکتری ها بصورت تصاعد هندسی کاسته می شود. بسته به نوع باکتری مرحله رکود و مرگ متفاوت است. دربعضی از باکتری ها (باسیلوسها) خیلی سریع انجام می شود و حتی محیط، عاری از باکتری زنده می شود. اما در برخی باکتری ها مثل انتروباکترها به ویژه Ecoli این دو مرحله روند کندی دارد. دراین مراحل باکتری ها ممکن است اشکال غیرمتعارف پیدا کنند (رشته ای) و حتی توان تقسیم شدن را ندارند ، همین طور پروتئین هایی را ایجاد می کنند که اصطلاحاً پروتئین های گرسنگی نامیده می شوند که این پروتئین های گرسنگی در E coli کمک می کند تا باکتری دوام بیشتری پیدا کند.

باکتری های هاگ گذار یا اسپورزا به فاز اسپورزایی می روند. کلستریدیوم ها و باسیلوس ها به مرحله اسپورزایی می رسند به شکل مقاوم در می آیند. در یک تعلیق باکتریایی حتی اگر خالص باشد باکتری هایی هستند که یک اختلاف زمان تولد دارند این سن ممکن است درحد ثانیه یا دقیقه باشد در نتیجه دراین تعلیق بعضی باکتری ها جوان ، بسیار جوان، پیر یا میانسال باشند اگر ریز شویم این تعلیق، تعلیق ناهماهنگ ازلحاظ سن است. دراکثر مواقع ما با یک کشت ناهماهنگ روبه رو هستیم که دراکثر مواقع این ناهماهنگی مشکلی ایجاد نمی کند. اما گر خواستیم کشت هماهنگ یک سن ایجاد کنیم می توانیم از یک فیلتر صافی رد کنیم و بعد این فیلتر را برعکس کرده و در روی این فیلتر محیط آبگوشت را اضافه کنیم و هر لحظه آب گوشت رد شده از فیلتر را در لوله جمع می کنیم در لوله ها باکتری های هم سن خواهیم داشت. به این نوع رشد ، رشد هماهنگ یا Synchronous growth می گوئیم .

روش دیگر : Helmstetler است

اما این هم سنی مطلق نیست و با گذشت زمان هماهنگی خود را از دست می دهد، مجدداً به شکل ناهماهنگ تبدیل می شود . با روش های خاصی می توانیم تا حدودی این هماهنگی و هم سنی را حفظ کنیم. محیط های غیر تجدید شونده درمحیط های آزمایشگاه است این نوع کشت ها را بسته می نامند . Close culture یا Bach ( بچ کالچر )

اگر کشت باکتری را ازحالت بسته در بیاوریم به این ترتیب محیط کشت را همواره در اختیار باکتری قرار دهیم که محیط کشت تجدید شود و ضایعات و سموم را خارج کنیم. یک محیط همواره درحال رشد خواهیم داشت که به این محیط، کشت مداوم یا Continuse می گویند. اساس بسیاری از واکسن سازی ها در حجم زیاد کشت مداوم است. لازمه این کار داشتن مخزنی است که باکتری درمحیط رشد کند و سیستمی داشته باشیم که مواد را همواره وارد محیط کند. این مخزن حجم مشخصی دارد، باید خروجی داشته باشد و محیط در حالت تعادل و همواره تازه باشد. ورود و خروج متعادل شرایط محیط تازه است. (صفحه ۳۰۳ کتاب) این نوع کشت را مداوم می نامند. این کشت مداوم را در مؤسسات واکسن سازی داریم اصطلاحاً این را سیستم فرمانتوری phermantory می نامند. این سیستم می تواند بوسیله یک ماده شیمیایی کنترل شود. معمولاً درمرحله رشد لگاریتمی باید داشته باشد تا حداکثر رشد باکتری و توکسین را داشته باشیم.

می توانیم با ماده غذایی کنترل کنیم روش chemostat رشد متعادل و مناسب است. با این روش میزان کدورت Turbidostat را کنترل کنیم که بوسیله چشم الکترونیکی تنظیم می شود.

فصل هشتم کتاب : ژنتیک باکتری ها :

( از کتاب ژنتیک باکتری ها و مبانی زیست مولکولی و مهندسی ژنتیک استفاده کنید.)

همانند سایر موجودات زنده تمامی خواص که درباکتری ها می بینیم منشأ گرفته از اطلاعات ژنتیکی است . اطلاعاتی که داخل کروموزوم بصورت ردیف های بازی قرار گرفته اند . ژنوم باکتری ها هم از سه ماده تشکیل شده . بازهای آلی ، قند ۵ کربنی ریبوز (RNA) و دزوکسی ریبوز(DNA) و همینطور فسفر یا فسفات است.

این سه ترکیب از عالی ترین یاخته ها ها تا پست ترین آن ها تشکیل دهنده مولکول DNA یا RNA هستند. اطلاعات ژنتیکی به غیر ازتعدادی از ویروس ها در سایر موجودات زنده ازجمله باکتری ها در مولکول DNA نهفته شده است.

ساختمان مولکول DNA : که بازهای پورینی و پیریمیدینی بوسیله ازت شماره ۹ یا ازت شماره ۱َ به کربن شماره ۱ قند دزوکسی ریبوز متصل می شود و این دو تا ماده را اصطلاحاً نوکلئوزید می نامند ( قند+ باز) این نوکلئوزیدها بوسیله پل ها یا پیوندهای فسفات به هم متصل می شوند به نوکلئوزیدهای قبلی و بعدی وقتی که فسفر به قند و باز متصل است (فسفر+ قند+ باز : نوکلئوتید) نوکلئوتید نامیده می شود.

مولکول DNA از نوکلئوتید های حاوی بازهای G,C, T,A (آدنین، تیمین، سیتوزین، گوانین) تشکیل شده ، طول هر یک از این زنجیره ها دریاخته های مختلف متفاوت است . در یاخته های پروکاریوت و یوکاریوت طول DNA زیاد است اما این زنجیرها همواره در داخل یاخته ها بصورت جفت و به هم پیچیده وجود دارند ( مارپیچ دوتایی DNA) این پیچش و چرخش به حدی زیاد است که این اندازه بسیار طویل DNA داخل یاخته ها می تواند جای بگیرد .

مولکول DNA حالت سوپرفلیکس (فوق مارپیچی) دارد. ساختمان سه بعدی این مولکول حدود ۶۰ سال پیش شناسایی و ترسیم شد. به این ترتیب که در مارپیچ دوتایی مولکول DNA هرنوکلئوتید،هرباز نسبت به باز مجاور خود حدود ۶/۳۴ درجه می چرخد. برای اینکه مولکول DNA چرخش کامل پیدا کند باید حدود ۴/۱۰ باز دراین چرخش دخالت کنند

۳۶۰  ۸۴/۳۵۹= ۴/۱۰ × ۶/۳۴

این چرخش کامل دارای یک تورفتگی هایی است که بعضی ازآنها کوچک Minor groove و برخی بزرگ (Major groove) است. معمولاً طول فرورفتگی کوچک nm ۲/۱ و تورفتگی بزرگ nm ۲/۲ است بنابراین طول یک چرخش کامل مولکول DNA nm۴/۳ است. فاصله هرکدام ازاین بازها ازهم حدود nm ۳۳/۰ تا ۳۴/۰ است اما قطر مارپیچ دوتایی DNA حدود nm ۳۷/۲ است . این مولکول DNA اصطلاحاً مولکول DNAB  نامیده می شود که نوع B-DNA فرم طبیعی و معمولی DNA است.

انواع دیگری از DNA وجود دارد A-DNA و Z-DNA که اشکال غیرمتعارف و غیر طبیعی DNA هستند در A-DNA طول کمتر و به ۴۶/۲ nm می رسد (کوتاه تر) تعداد نوکلئوتیدها که درنوع –B-DNA ، ۴/۱۰ بود ۱۱ تا می شود قطر آن بیشتر از ۳۷/۲ و به ۵۵/۲ nm می رسد. بنابراین ADNA کوتاه تر و قطورتر است.

اما Z-DNA یا زیگزاگ DNA ای است که باریک تر و طویل تر است طول ۵۶/۴ nm ، تعداد نوکلئوتیدها ۱۲ تا اما با قطر آن ۸۴/۱ nm است.

در زمان همانند سازی مولکول DNA ای که بصورت زنجیره دوتایی است باید از هم باز شود و از روی زنجیرها، زنجیرهای جدید ساخته شود .در روند همانند سازی (DNA Replication) طی فرآیندهای خاصی دو زنجیر باز شده و هرکدام بعنوان الگو (Template) عمل می کنند که از روی این الگوها در طی روند همانند سازی رشته های جدیدی ساخته می شود به این ترتیب که درروند همانند سازی پروتئینی به نام dnaA می آید ناحیه ای که باید شروع همانند سازی از آن نقطه شروع شود را پیدا می کند. این نقطه که همانند سازی ازآنجا  شروع می شود را منشأ همانند سازی (Origin of replication) یا ori می نامند.

ori دریاخته های مختلف اسامی مختلفی دارد در E coli Ori C ,   می نامند ( منشأ همانند سازی) وقتی پروتئین A dna  این نقطه را پیدا کرد همانند سازی ازآن نقطه DNA بصورت دو طرفی انجام می شود کروموزوم در باکتری ها حالت کروی و بسته دارد (Circle & close) و شکلی شبیه به  دارد.

وقتی نقطه همانند سازی پیدا شد دو زنجیر باید از هم باز شوند و هرکدام بصورت الگو قرار بگیرند به همین دلیل پروتئین دیگری بنام پروتئین dna B به این نقطه اضافه می شود که این پروتئین نوعی آنزیم است که خاصیت هلیکازی دارد (بازکننده پیچ) به این نقطه پروتئین دیگری اضافه می شود بنام پروتئین dna C این پروتئین بین این دو رشته که دارد باز می شود قرار می گیرد و کمک به باز نگه داشتن دو رشته می کند. به این مجموعه پروتئین دیگری بنام SSBP SSBP= Single ctruncled Binding protein یا پروتئین اتصالی تک رشته ای شده اضافه می شود وقتی که دراین نقطه شروع همانند سازی این پروتئینها اضافه شدند پروتئین دیگری به نام Primases پریماز اضافه می شود سپس پروتئین های n ، nَ  ، n” ، i به آن نقطه اضافه می شود.در نهایت پروتئین دیگری بنام rep اضافه می شود که نوعی آنزیم است ازجنس هلیکاز و شبیه به dna B عمل می کند اما سرعت بازکنندگی آنزیم rep بیشتر از dna B است زیرا آنزیم DNA پلی مراز سرعت زیادی دارد. بنابراین باید به سرعت باز شود، پروتئین یا آنزیم پریماز درواقع یک نوع RNA پلی مراز است که می آید قطعه ای از RNA را سنتز می کند که اصطلاحاً پرایمر (primer) نامیده می شود . در این موقع         ۲ نوکلئوتید َ۳- OH (کربن َ۳ قند ریبوز) آن آزاد است . درنتیجه مجموعه ای از پروتئین ها، نوکلئوتید ها جمع شده و زنجیر را آماده سنتز می کنند.

عمل سنتز توسط DNA پلی مراز انجام می شود. ما سه نوع آنزیم DNA پلی مراز داریم:

Pol  I

Pol  II

Pol  III

Pol  III  نقش اساسی در همانند سازی مولکول  DNA دارد، سرعت آن ۳۰۰ برابر Pol  II و ۱۵ برابر Pol  I است یک هولوآنزیم است که از تحت واحدها و پلی پپتیدهای مختلف تشکیل شده که به این مجموعه پروتئین ها اضافه می شود . این مجموعه را چنگال همانند سازی (Replisome= Replication Fork) می گویند.این چنگال در دو جهت شروع به همانند سازی می کند در نتیجه  دو چنگال داریم.

خاصیت Pol  II این است که زنجیر جدید را درجهت َ۵  به  َ۳ سنتز می کند بنابراین زنجیرهای الگو که
Antiparalel هستند از َ۳ به َ۵ مستقیم نمی تواند بسازد. دراین مرحله پرایمرها وصل شده OH– َ۳ را دراختیار Pol  II قرار می دهند و زنجیره قطعه قطعه ساخته می شود.

َ۳  َ۵                                      َ۵  َ۳

َ۵    َ۳                   َ۳  َ۵

به همین دلیل از روی زنجیر طرحی َ۵ به َ۳ عمل همانندسازی بصورت تکه تکه انجام می شود که این قطعات را قطعه های اوکازاکی می نامند . این قطعات که متشکل از ۱۰۰۰ و ۲۰۰۰ نوکلئوتید است و وسط آنها پرایمر قرارگرفته بعداً بوسیله آنزیم Pol  III که خاصیت ایزونوکلئازی هم دارد پرایمرها را حذف نموده و توسط آنزیم لیگاز DNA به هم متصل می شوند. این زنجیره تکه تکه را اصطلاحاً زنجیر Lagging strand یا زنجیره با لکنت می نامند.این زنجیره ها که جدید ساخته شدند بایستی به نسل بعدی منتقل شوند : دو زنجیره جدید داریم و دو زنجیره قدیمی. این که کدام یک در یاخته مادر می مانند و کدام منتقل می شوند دو نظریه داریم :

قدیمی ها در یاخته مادر می مانند و جدیدها منتقل می شوند                 ۱-Consevative

براساس نیتروژن ۱۴و ۱۵ انجام می دهند   ۲-Meselson & stall(semiconsevative)

نظریه اول نظریه درستی نیست بلکه نظریه دوم یا نظریه semiconsevative درست است این بدین معنی است که یک زنجیر جدید با یک زنجیرقدیم جفت شده در مادر و یک زنجیر جدید با قدیم جفت شده و به یاخته دختر منتقل می شود. از نظر منطقی هم درست است چون ممکن است در همانند سازی رشته های جدید اشتباهاتی رخ دهد. باید الگوی درست باشد و آن طرح الگو یا مادر است که بتواند اشتباهات جدید از روی مادر یا الگو اصلاح شود.

شروع نسخه برداری :

شامل مراحل شناسایی قسمت ابتدایی ژن ها ؛ تشکیل کمپلکس نسخه برداری و ساخت چند ریبونوکلئوتید اولیه می باشد.توالی های DNA که در آنها نسخه برداری شروع می شود؛ آغازگر یا Promotor نامیده می شوند. آغازگرها همواره در قسمت َ۵ ژن قرار دارند زیرا نسخه برداری نیز همانند سازی از جهت َ۵ به َ۳ است. آنزیم RNA پلی مراز وابسته به DNA جهت رونوشت برداری اش َ۵ به َ۳ است. با بررسی Promoter های مختلف مشخص شده که آنها دارای ساختمان تقریباً مشابه وترادف های بازی مشابهی هستند به همین دلیل این توالی های مشترک را consensus sequence (ردیف های همسان ) می نامندکه در واقع موثرترین آعازگرها برای آنزیم RNA پلی مراز است . این ردیفهای یکسان  دارای نواحی مختلفی هستند که شامل:

ناحیه اول ، ناحیه ۳۵ – است ، ناحیه ای است کهبیشتر ژنهای این ناحیه یک قطعه شش نوکلئوتیدی دارند که توالی همسان آن (TTGACA) است.

ناحیه دوم ، ناحیه ۱۰- است، ناحیه ای است که یک قطعه شش نوکلئوتیدی دارند که توالی همسان آن  (TATAAT) است. ناحیه ۱۰- را با عنوان جعبه TATA یا جعبه پریبنو Pribnow box می شناسند.

ناحیه سوم ناحیه ۱+ است که دراین ناحیه همواره با یک بازپورینی A یا G آغاز می شود و اولین بازی است که در شروع نسخه برداری دخالت دارد.

 

۱+                         ۱۰-                             ۳۵-

معمولا بین ناحیه ۱۰- و ۳۵- حدود ۱± ۱۷ نوکلئوتید فاصله وجود دارد.

بنابراین آنزیم RNA پلی مراز که دارای ساختمان  است برای شروع رونوشت برداری این ناحیه را که اصطلاحاً پروموتر می گویند شناسایی می کند.

عملکرد آنزیم و رسیدن آن به ژن :

عامل سیکما ( ) عاملی است که عمل شناسایی توالی های یکسان را انجام می دهد. هنگام حرکت آنزیم RNAپلی مراز برروی DNA ؛ فاکتور یا عامل سیکما ابتدا از توالی منطقه ۳۵- یک پیام دریافت می کند که به قسمت های اصلی آنزیم مخابره می شود و نزدیک شدن به محل شروع نسخه برداری را نشان می دهد.سپس از ناحیه ۱۰-  پیام قویتری دریافت می کندآنزیم وقتی به ناحیه ۱۰- رسید، پیام این امواج از سیکما به تنه آنزیم شدیدتر می شود و آنزیم متوجه نزدیکی به مولکول DNA می شود و در نهایت آنزیم RNAپلی مراز پس از دریافت این پیام دو رشته DNA را از هم باز کرده درناحیه ۱+ روی DNA می نشیند(در اثر امواج سیکما به تنه آنزیم  عامل  این توانایی که پیدا می کند تا دو زنجیره DNA را در منطقه ۱+ ازهم باز کند ) و اولین نوکلئوتید را به RNA وارد می کند. اولین نوکلئوئید که وارد RNA می شود باید پیریمپدین باشد G یا U و به دنبال آن بازهای مکمل بعدی را یک به یک در جای خود و در جهت َ۳  َ۵ می باشد. به مجموعه RNA پلی مراز؛ فاکتور سیکما و قسمت اولیه باز شده DNA کمپلکس باز یا Open complex  می گویند.

پس ازاینکه چند نوکلئوتید اولیه RNA ساخته شد و RNA پلی مراز کمی به جلو حرکت کرد، پیوند بین فاکتور سیکما و آنزیم RNA پلی مراز سست شده و فاکتور سیکما آزاد شده و برای رونوشت برداری از ژن دیگر به RNA پلی مراز دیگری می چسبد.

مرحله طویل شدن یا ELONGATION

پس از جدا شدن عامل سیکما عامل فرعی دیگری به نام Nus A  دراین زمان به تنه آنزیم وصل می شود تا آنزیم RNA پلی مراز با سرعت بیشتری عمل رونوشت برداری را انجام دهد.این آنزیم کامل حدود ۱۸نوکلئوتید را در برمی گیرد .به مجموع RNA پلی مراز ؛ عامل فرعی وتوالی  ۱۸نوکلئوتیدی  یک حبابی را تشکیل می دهند که اصطلاحاً حباب نسخه برداری یا کمپلکس نسخه برداری نامیده می شود.

مرحله دوم رونوشت برداری Elongation (مرحله طویل شدن) است. این عمل طویل شدن RNA با سرعت زیادی بوسیله تنه آنزیم   و عامل فرعی Nus A انجام می شود. مشخص کرده اند که در این حباب تشکیل شده، سرعت ورود نوکلئوتیدهابه داخل جایگاه فعال آنزیم    است (۱۰ هزار بار در ثانیه وارد می شوند) اما عمل سنتز و پیشرفت RNA در هرثانیه بین ۳۰ تا ۸۵ نوکلئوتید در هر ثانیه است . بنابراین عملکرد RNA پلی مراز با توجه به مواد وارد شده کند تر است که علت آن این است که چند کار با هم انجام می دهد مثل اضافه کردن، باز کردن زنجیره های DNA از هم ، تطابق بین بازهای جدید و بازهای DNA تا بازها اشتباه جاگذاری نشوند و در آخر متصل کردن زنجیره های DNA  به هم کارهایی است که آنزیم RNA پلی مراز انجام می دهند.

در رونوشت برداری برخلاف همانند سازی عمل غلط گیری و تصحیح وجود ندارد در نتیجه سرعت آنزیم کندتر از سرعت آنزیم درهمانند سازی است .DNA پس از ساخت باید دچار پیچ خوردگی شود تا بتواند داخل یاخته قرار بگیرد تنظیم این پیچ و تاب خوردن ها توسط آنزیم های توپرایزومراز انجام می شود.

مرحله سوم: خاتمه نسخه برداری:

دو مکانیسم شناخته شده است: ۱-  مکانیسم خاتمه ساده یا simple termination : در این نوع توالی های انتهای غنی از G و C یا نواحی ایستگاه Pause Site  باعث خاتمه نسخه برداری می شود.

۲-  خاتمه وابسته به فاکتور Rho:

در هر دو مکانیسم نواحی ایستگاه وجود دارد با این تفاوت که در خاتمه ساده توالی ایستگاه بایستی حتما متقارن باشد در صورتیکه در مورد فاکتور Rho توالی ایستگاه متقارن نیست.

برای تثبیت مولکول DNA در یاخته های یوکاریوتیک و پروکاریوتیک DNA در روی پروتئین های خاصی استقرار پیدا می کنند . این پروتئین ها را هیستون می نامند . انواع مختلفی از این هیستون ها در یاخته ها وجود داردکه عبارتند از H1,H2A , H2B, H3 ,H4 . مشابه این  پروتئینها در یاخته های پروکاریوتیک و باکتری ها دیده می شود که آنها را اصطلاحاً (HLP) Histon like protein می نامند، که در باکتری هم انواع مختلفی ازآن وجود دارد مثل  . این مسئله باعث می شود مولکول طویل و باریک DNA بتواند داخل یاخته هایی که کوچکتر از DNA هستند قرار بگیرد. مسئله مهم بعد از همانند سازی مسئله رونوشت برداری یا نسخه برداری است (Transcription) که اولین پدیده در سنتز پروتئین است .

اطلاعات ژنتیکی درون DNA باید بصورت عملکردی و فعالیتی در بیاید تا بتواند خاصیت و واکنشی را در یاخته ایجاد کند. این پدیده سنتز پروتئین دارای مراحل مختلفی است اولین مرحله، مرحله رونوشت برداری است . باید ردیف های نوکلئوتیدی DNA به زبان دیگری نوشته شود و آن زبان ، زبان RNA است.آنزیمی در پدیده رونوشت برداری دخالت می کند که اصطلاحاً آن را RNA پلی مراز وابسته به DNA                   DNA dependent RNA polymerase می گویند. در باکتری ها مثل ای کلای معمولاً یکی از این آنزیم ها را داریم در صورتی که در یوکاریوت ها تعداد این آنزیم ها مختلف و متفاوت است . این آنزیم هم دارای ساختمان خاصی است بطوری که از یک سری تحت واحد های اصلی و تعدادی تحت واحدهای فرعی تشکیل شده تحت واحدهای اصلی شامل دو تحت واحد α و  است که اصطلاحاً:  (core) یا تنه اصلی آنزیم می گویند. به این core آنزیم دو تحت واحد فرعی هم درزمان رونوشت برداری اضافه می شود یکی از این تحت واحدهای فرعی فاکتورδ و تحت واحد بعدی عامل Nus A  به این تنه و ریشه اصلی آنزیم متصل می شود. وقتی این تحت واحدها بخصوص سیکما به تنه اصلی آنزیم متصل شد آنزیم تبدیل به هولو آنزیم ( آنزیم عملکردی) می شود . اما رونوشت برداری از DNA عملی است که در سه مرحله انجام می شود.

مرحله اول ، آغازی یا Initiation می نامند که دراین مرحله بایستی جایگاه های خاصی در مولکول DNA مورد شناسایی قرار بگیرند این جایگاه ها که خاص هر ژن است اصطلاحاً promoters می نامند. با توجه به این که داخل باکتری ها ژن های مختلفی وجود دارد می توان تصور کرد که ژن هایی که با هم عمل می کنند دارای یک promoter خاص هستند در نتیجه  درهر یاخته ای تعداد زیادی از این promoter ها دیده می شود. فعالیت آنها در مورد ژن های مختلف متفاوت است بعضی فعال هستند و ممکن است درهرثانیه باعث شروع رونوشت برداری شوند اما بعضی در هر سال یک بار فعالیت می کنند. به همین دلیل در مهندسی ژنتیک و تولید فرآورده های بیولوژیک که ژن را وارد باکتری می کنیم تا پروتئین خاصی تولید کنیم باید از پروتئین ها به میزان متناسب تولید کنیم. انواع مختلفی از promoter ها وجود دارد که در قسمت َ۵ مولکول DNA قرار می گیرد و دارای ساختمان خاصی است .

مرحله دوم : متصل کردن زنجیره های DNA ( Rewinding یا باز کردن زنجیره های( DNA unwinding  یا بستن پیچها و زنجیره های DNA است .

مرحله سوم، مرحله خاتمه Termination است . پس از رونوشت برداری ، عمل آنزیم باید متوقف شود. مکانیسم های مختلفی ذکر شده یکی از این مکانیسم ها، خاتمه ساده simple termination است.

در انتهای ژن ها نواحی غنی از C,G وجود دارد این نواحی    باعث می شود سرعت آنزیم RNA پلی مراز وابسته به DNA کاهش پیدا کند چون پیوند هایی که بین C,G وجود دارد پیوند های سه گانه است ، وقتی آنزیم به این نواحی می رسد باید زمان و انرژی زیادی برای unwinding  این قطعه صرف کند و باعث کاهش سرعت آنزیم می شود. و آنزیم در حالت بین دویدن و ایستادن قرار می گیرد (در حالت pause) نه درحال ساختن و نه توقف ،درنتیجه این نواحی را pause site می نامند. (جایگاه های نیمه متوقف) : باعث جدا شدن Nus A و توقف فعالیت آنزیم می شود.

مکانیسم دیگر مکانیسم خاتمه وابسته به فاکتور Rho است یا (Rho Termination) عامل Rho عاملی است که خاصیت هیلکازی دارد و به حباب نسخه برداری وصل می شود و یکی از کارهایی که انجام می دهد این است که هیبربدRNA: DNA را از هم جدا می کند. این پیوند را مهار می کند. به همین دلیل باعث خاتمه رونوشت برداری می شود.

دانستن مکانیسم رونوشت برداری یکی از کاربردهای آن درمان بیماری های باکتریایی است. آنتی بیوتیک هایی هستند که در مکانیسم رونوشت برداری مداخله می کنند و از این طریق باعث مرگ باکتری ها می شوند ازجمله ریفامپین آنتی بیوتیک پرمصرفی است که ازمرحله دوم جلوگیری می کند.

این RNA ای که از روی DNA رونوشت برداری می شود را mRNA می نامند (mRNA DNA ) mRNA که کپی ای از ژن هست به سطح ریبوزوم منتقل می شود. mRNA به تحت واحد کوچکتر (۳۰s ) متصل می شود RNA درمقایسه با DNA ها بسیار حساس تر هستند معمولاً تک رشته ای اند یکی از عوامل حساسیت آن ها همین نداشتن پیوند هیدروژنی و تک رشته ای بودن آنهاست. RNA پیامی است از DNA که بصورت سه بازی و کدون هاست.

درساختمان پروتئین ها حداقل ۲۰ نوع اسید آمینه مختلف وجود دارد بنابراین حداقل ۲۰ رمز باید وجود داشته باشد. درنتیجه پیام هایی که از DNA به mRNA داده می شود سه بازی است که می توانند ۶۴ حالت مختلف را ایجاد کنند که به آنها کدون یا رمز ژنتیکی می گویند.این کدها (۶۴ کد) درصفحه ۳۳۲ کتاب وجود دارد .

دراین جدول به غیر از سه تا از کدون ها، هرچند تا یک اسید آمینه را شامل می شوند. فقط برای تریپتوفان و متیونین  یک کدون وجود دارد اما سه کدون هم هستند که کدون های بی معنی هستند :

کدون های UGA, UAG , UAA                                    UAA                     Ochre

                                                                            UAG                    Amber

UGA                    opan

mRNA به ۳۰S ریبوزوم متصل می شود . یک کدون شروع کننده به نام AUG داریم و آن را کدون شروع کننده می نامند. در تحت واحد برزگتر ریبوزوم دو جایگاه داریم. جایگاه پپتیدیp=peptidi و جایگاه آمینواسیدی (Acceptory) = A اولین کدونی که درموقع سنتز پروتئین بوجود می آید AUG است .

tRNA  ساختمان برگ شبدری است یک قسمت ، قسمت رمزگشا است که شامل سه بازی های مختلف است که به آنها آنتی کدون می گویند (Anticodon) ،هرکدام ازاین آنتی کدون ها روی tRNA درواقع اختصاصی یک نوع اسیدآمینه اند یا بعبارت دیگر ما ۲۰ نوع tRNA داریم که حداقل بوسیله ۲۰ نوع  اسید آمینه یا a.a مختلف باردار می شود و منتقل می شود به تحت واحد ۵۰S ریبوزوم.

آمینو اسید tRNA سنتتاز باعث متصل شدن a.a خاص به tRNA خاص و آنتی کدون های خاص اولین اسیدآمینه –N, فرمیل متیونین است.پس ازانجام این عمل ریبوزوم به اندازه سه کدون حرکت می کند. درناحیه A توسطtRNA  مخصوص ترجمه می شود. آنزیم پپتیدیل ترانسفراز بین اسیدآمینه جایگاه P و اسیدآمینه جایگاه A پیوند پپتیدی برقرار می کند و زنجیر پپتیدی به اندازه یک a.a بزرگ می شود . بدین ترتیب ادامه پیدا می یابد.

درباکتری ها، بخصوص باکتری های آزادزی تعداد نسبتاً زیادی ژن وجود دارد بطوری که بین ۱۰۰۰ ،۱۵۰۰ تا ۵۰۰۰ تخمین می زنند درباکتری مثل E coli حدود ۵۰۰۰ – ۴۰۰۰ ژن وجود دارد . اما این باکتری در محیط های مختلف و در شرایط مختلفی قرار دارند . یکبار در محیط خاک است یک بار در آب است ، یک بار در بدن انسان ها و حیوانات با انواع ترکیبات، یک بار در محیط های کشت، اما سئوال اینجاست که E coli دراین محیط ها همواره ازاین ۴۰۰۰ تا ۵۰۰۰ ژن رونویسی می شود . همه آنزیم ها و pr ها شناخته می شوند.

مثلاً درخاک که قند وجود ندارد چرا باکتری آنزیم های هضم قند را بسازد. آنزیمی که نهایتاً هیچ کارکردی ندارد . اما همین باکتری درمحیط لاکتوز باید این آنزیم ها را تولید کند بهتر رشد و ادامه نسل دهد. به همین دلیل می توان ژن های داخلی باکتری ها را به دو دسته تقسیم کرد. ژن هایی که همواره برای حیات باکتری در همه جا ضروری هستند و همواره رونوشت برداری شدند ، ژن های همیشه فعال (همیشه سازنده) می گویند. باکتری ها موجودات دقیق و حسابگری هستند بطوری که کار عبث و بیهوده انجام نمی دهند.

دسته دوم ژن ها که درموقع لزوم و ضرورت درزمانی که سوبسترا درمحل باشد فعال می شوند این نوع ژن ها را ژن های انگیزه پذیر می نامند. مکانیسم هایی که باعث می شود باکتری این گونه عمل کند مکانیسم ژنی است که اولین بار آقای ژاکوب و فولو کشف کردند.آنها مکانیسمی را که برای تنظیم ژنی پیدا کردند را اپرون لاکتوز نامیدند. اگر باکتری را فقط در محیطی که گلوکز دارد کشت دهیم آنزیم های مربوط مصرف لاکتوز را تولید نمی کنند اما اگر درمحیط حاوی لاکتوز کش

ت دهیم آنزیم مربوط به مصرف لاکتوز را می سازد :کنترل بروز ژن :

سه نوع آنزیم : لاکتوز پرمه آزLactose permease –              لاکتوز را از محیط وارد باکتری کند.

بتاگالاکتوزیداز – galactosidase

تیوگالاکتوزیدترانس استیلاز Thiogalactoside transacetylase       لاکتوز را استیله و تجزیه و وارد چرخه کربس می کنند

باکتری این سه نوع آنزیم را که برای مصرف لاکتوزلازم است را همزمان باید تولید کند چون اگر همزمان تولید نشوند هدف که مصرف لاکتوز است تأمین نمی شود. دراین حالت هماهنگی و هارمونی تولید یا عدم تولید باید بین این سه آنزیم باشد. این سه آنزیم توسط سه ژن رمز می شوند که به آنها ژن هایlacA,lacZ,lacY  می گویند.ژنی که آنزیم لاکتوز پرمه از را کد می کند lacY ،ژنی که بتا گالاکتوزیداز را رمز میکند lacZ و ژنی که تیوگالاکتوزیدترانس استیلاز را رمز می کند lacA می باشد.

روشن شدن و خاموش شدن آنها باید هماهنگ باشد تا اپرون لاکتوز مفید عمل کند. هردسته ژنی یا اپرونی ازژن ها یک promoter دارد که RNA پلی مراز طبق روند ذکر شده رونوشت برداری را انجام می دهد.

تنظیم بروز ژنی :

قبل از هر Prometer یک ژن وجود دارد که آن را ژن تنظیم کننده می نامند (Regulator)  این ژن تنظیمی حالت همیشه فعال دارد و فرآورده ای بنام ممانعت کننده (Inhibitory) می سازد . بنابراین ژن آن را  می نامند.دوجایگاه یا رسپتور دارد. یک رسپتور برای لاکتوز (اگر درمحیط باشد) یک رسپتور برای چسبیدن به پروموتور اپرون لاکتوز. وقتی لاکتوز در محیط نیست این ماده ممانعت کننده آزاد است و به Promotor اپرون لاکتوز متصل می شود و جلوی فعالیت آنزیم را می گیرد. (جلوی آنزیم RNA پلی مراز وابسته به DNA) در نتیجه سه آنزیم مصرف کننده لاکتوز ساخته نمی شود.وقتی لاکتوز درمحیط باشد : لاکتوز به ماده ممانعت کننده وصل می شود و باعث تغییر شکل آن می شود در نتیجه ماده ممانعت کننده توانایی اتصال به Promoter اپران لاکتوز را پیدا نمیکند بنابراین رونوشت برداری از ژنها انجام می شود در نتیجه آنزیم ها ساخته می شوند.

یکی دیگر ازروش ها ممانعت یا سرکوبی ناشی از فرآورده های انتهایی End product repression است.در سنتز اسیدهای آمینه معمولاً حالت یا تمایل یاخته ای برساخته شدن اسیدآمینه است به این ترتیب که درساختمان یاخته ۲۰ نوع a.a است.یاخته همراه به تریپتوفان نیاز دارد مگر آنکه بیش از اندازه تولید شود دراین حالت باید جلوی تولید آن گرفته شود. برای سنتز تریپتوفان ۵ مرحله، ۵ ژن و ۵ آنزیم مختلف دخیل هستند که باید به صورت هارمونیک عمل کنند. ماده تنظیم کننده این ژن درحالت معمولی آزاد است و به پروموتور ژن های مربوط به سنتز تریپتوفان وصل نمی شود. اما وقتی زیاد ساخته شد تریپتوفان اضافی به ماده تنظیم کننده وصل می شود و باعث می شود تمایل ماده تنظیمی برای چسبیدن به promoter ژن های مربوط به سنتز تریپتوفان افزایش پیدا کند و مانع چسبیدن آنزیم های ساخته شده (۵ آنزیم) شود.

یکی دیگر از این روش ها : سرکوبی کاتابولیت Catabolite repression است: باکتری ها بصورت حسابگرانه عمل می کنند. مثلاً  E coli را درمحیط حاوی گلوکز و لاکتوز است ، تا زمانی که گلوکز درمحیط است آنزیم های مربوط به مصرف لاکتوزرا تولید نمی کند اما زمانی که گلوکز تمام شد لاکتوز را مصرف می کند. درحضور گلوکز میزان آنزیم ادنیلات سیکلاز کاهش می یابد. این آنزیم ، آنزیمی است که باعث تولید CAMP می شود و درنتیجه CAMP هم کاهش می یابد. برای فعال شدن اپرون لاکتوز یکی از محرک ها، محرک CAP است (CAP) Catabolic activator protein اگر کمپلکس CAMP+ CAP تولید شود باعث تحریک اپرون لاکتوز و فعالیت اپرون لاکتوز را افزایش می دهد. با کاهش آدنیلات سیکلاز میزان  CAMP کاهش می یابد. باکاهش CAMP ؛ کمپلکس CAP + CAMP کاهش می یابد در نتیجه باعث کاهش عملکرد اپرون لاکتوز و تحریک آن می گردد.

تنظیم شرایط بحرانی یا سخت (control)

باکتری در زمان فقر غذایی و یا فقر a.a سعی می کند در شرایط قحطی جوری فعالیت هایش را تنظیم کند که بیشتر زنده بماند . دو ماده فسفردار pp G pp، pppG pp در شرایط سخت افزایش می یابد و حالت خواب را به باکتری می دهد . باکتری های اسپورزا ، اسپور تولید می کند و آنها که اسپورزا نیستند میزان رونوشت برداری را کاهش می دهند تا زنده بمانند.

تنظیم فعالیت آنزیمی صفحه ۳۵۲ و ۳۵۳

فعالیت آنزیم ها بصورت برگشتی یا feed back کنترل می شود.

موتاسیون (Mutation)

موتاسیون : پدیده ای است که درهمه موجودات زنده رخ می دهد چه یوکاریوت چه پروکاریوت (باکتری ها و ویروس ها). دربدن خود انسان که متشکل از میلیاردهاسلول در حال تقسیم و تولید است پدیده موتاسیون (تغییر ژنتیکی) رخ می دهد اما سیستم ایمنی بدن این تغییر را حذف می کند( بعنوان یاخته بیگانه شناسایی و آنرا حذف می کند) اما درموارد خاصی این یاخته های موتان یافته ازدست سیستم ایمنی بدن فرار می کنند که متأسفانه باعث بروز سرطان در موجودات می شوند. درمورد باکتری ها هم با همین فراوانی موتاسیون اتفاق می افتد.

فرکانس موتاسیون درهمه یاخته ها تقریباً یکسان است (  ) این موتاسیون اساس ژنتیکی دارد. به همین دلیل به نسل های بعدی هم منتقل می شود در نتیجه پدیده ای است ناگهانی، وراثتی، ژنتیکی که قابل انتقال به نسل های بعدی است.

چون تولید نسل باکتری ها سریع انجام می شود به همین دلیل موتاسیون درباکتری ها یک بحث اساسی است . تصور می شود موتاسیون درباکتری ها فراوانی اش بیشتر باشد.

 

 

درمورد E . coli یک ویژگی می تواند دو حالت داشته باشد ،

  • حالت وحشی (wild type)
  • حالت موتانت یا سویه موتانت (Mutant)

اگر تعداد کمی از E-coli را روی محیط کشت ی که حاوی استرپتومایسین است اضافه کنیم چون سویه وحشی نسبت به این آنتی بیوتیک حساس است روی این محیط رشد نمی کند اما اگر تعداد  باکتری Ecoli را دراین محیط کشت دهیم با توجه به تعداد باکتری ها زیاد شده و فرکانس ایجاد سویه  است پس دراین  باکتری Ecoli ، ۱۰۰ باکتری مقاوم به استرپتومایسین خواهیم داشت که می تواند روی محیط حاوی استرپتومایسین رشد کند. این سویه های موتانت مقاوم به استرپتومایسین همواره به آن مقاوم اند اما اگر تعداد زیاد شود و  ازآنها را داشته باشیم، استرپتومایسین یک پدیده رفت و برگشتی است که می تواند به صورت برگشتی سویه موتان را به وحشی و سویه وحشی را به سویه موتان تبدیل شود . مثال دیگر:

سالمونلا تیفی S.typhi ( عامل تیفوس درانسان ) که نسبت به اکثر مواد حالت پروتروفی دارد. عامل رشد را می تواند سنتز کند بغیر از اسید آمینه تریپتوفان. بنابراین اگر درمحیط کشت تریپتوفان اضافه نکنیم سالمونلا تیفی نمی تواند رشد کند. سویه وحشی آن Try منفی است. اگر دریک محیط کشت آبگوشت مقدار کمی در حد میکروگرم تریپتوفان اضافه کنیم رشد باکتری بصورت محدود انجام می شود.اما بعد از سه چهار روز می بینیم که محیط کاملاً کدر می شود. این نشان دهنده این است که در سالمونلا تیفی که کشت دادیم تعدادی سویه های موتانت   وجود داشته که بعد از سه الی چهار روز بتدریج زیاد شده و نهایتاً باعث کدر شدن محیط آبگوشت می شود. بنابراین موتاسیون پدیده ای است که همواره انجام می شود اما با فرکانس خاصی در سایر باکتری ها انجام می شود.

چگونگی موتاسیون

روش های متفاوت درسطح RNA, DNA وجود دارد :

  • اضافه شدن بازهای نوکلئوتیدی: در زمان همانند سازی ممکن است باز اضافی وارد مولکول DNA شود این حالت اضافه شدن باعث تغییر کدون ها در mRNA می شود و اسید آمینه ناخواسته وارد پروتئین می گردد و باعث بروز خاصیت غیرعادی درموجود می شود.
  • کاهش بازهای نوکلئوتیدی : برعکس حالت (۱) یا addition،  حالت کاهش یا Deletion است . سرعت بالای DNA پلی مراز باعث شود بازها جایگزین نشوند که باز مثل حالت قبل می شود.
  • تقاطع (Transversion): درجریان همانند سازی ممکن است یک باز پورینی (A یا G ) درجای یک باز پیریمیدینی (C یا T) جایگزین شود . این حالت را تقاطع می نامند که باعث تغییر کدژنتیکی و موتاسیون می شود.
  • تبدیل برزخی (Transition): بازهای یک گروه جایگزین گروه دیگر می شوند یعنی به جای پورین بازهای پیریمیدین به جای پیریمیدین بازهای پورینی جایگزین می شوند.

این چهار حالت تغییر درمولکول DNA بخصوص حالت ۱ و ۲ باعث می شود چهارچوب ساختاری و ساختمانی مولکول DNA تغییر پیدا کند. این نوع موتاسیون ها که باعث تغییر ساختمان می شود، موتاسیون های چهارچوب عوضی (Frame schift mutation) می نامند. این موتاسیون ها که در یاخته ها چه پروکاریوتیک و چه یوکاریوت انجام می شود دارای خواصی است ازجمله خواصی که در پدیده موتاسیون وجود دارد حالت عدم پیوستگی است یعنی موتاسیون یک پدیده غیرپیوسته است . اگر دریک باکتری موتاسیون را ببینیم ،سویه یا نسبت به آن خاصیت دارای موتاسیون هست یا نیست. Ecoli یا به استرپتومایسین حساس است یا مقاوم . حالت سریالی یا نردبانی ندارد و حالت بینابینی ندارد کمی حساس و کمی مقاوم نداریم : ازقانون همه یا هیچ تبعیت می کند.

مثلاً درمصرف لاکتوز سویه وحشی Ecoli لاکتوز را مصرف می کند اما در این سویه وحشی ممکن است موتاسیون شود وبه باکتری لاکتوز منفی تبدیل می شود: لاکتوز + سویه وحشی / لاکتوز – سویه موتانت (جهش یافته)

ویژگی بعدی، نادر بودن آن است (Rare) این پدیده بندرت اتفاق می افتد با فرکانس  درخواص مختلف متفاوت است . چون تکثیر باکتری ها با سرعت زیادی اتفاق می افتد مادر باکتری ها موتاسیون را بیشتر می بینیم اما انسان درطول زندگی دچار موتاسیون های مختلفی می شود که درمواقع خاصی مثل ضعف سیستم ایمنی این موتاسیون تبدیل به سرطان می شود.

ویژگی دیگر موتاسیون استقلال موتاسیون است . اگر باکتری دریک خاصیتی دچار موتاسیون شد هیچ دخالتی در موتاسیون های دیگر ندارد و این یاخته ممکن است درخواص دیگر هم دچار موتاسیون شود.

ویژگی دیگر ثبات موتاسیون است ، موتاسیون پدیده ژنتیکی است و سویه موتانت، وقتی دریک خاصیت دچار موتاسیون می شود این خاصیت ثبات دارد مگر اینکه دچار موتاسیون برگشتی شود.

ویژگی دیگر اختصاصی بودن موتاسیون است . به این معنی که وقتی باکتری دچار موتاسیون دریک خاصیت می شود این موتاسیون خاص آن خاصیت است و روی خواص دیگر معمولاً اثر نمی گذارد. هرچند موتاسیون دربرخی خواص روی خواص دیگر هم تأثیر گذار است بعنوان مثال اگر باکتری دچار موتاسیون شود و کپسول خود را از دست دهد ، سویه وحشی دچار کپسول است اما دراثر موتاسیون کپسول خود را از دست می دهد این سویه بدون کپسول موتانت نسبت به یاخته های بیگانه خوار بدن مقاومت خود را از دست می دهد درنتیجه بیماری زایی آن از بین می رود.

ویژگی دیگر آن خود به خودی بودن موتاسیون است . موتاسیون پدیده ای است که همواره اتفاق می افتد اما ما معمولاً نسبت به یک ماده و خاصیت این موتاسیون را می سنجیم، بنابراین تصور می شود این عامل است (لاکتوز، Tryو ..) که باعث موتاسیون می شود اما در حالت طبیعی این مواد که به آنها عوامل انتخاب کننده می گوئیم. درشرایط طبیعی نقشی درایجاد موتاسیون ندارند. مثلاً موتاسیون رانسبت به لاکتوز، try ، می سنجیم. آیا حضور استرپتومایسین است که باعث موتاسیون می شود یا نه؟ موتاسیون به صورت خودبخودی نسبت به استرپتومایسین انجام می شود.

برای شناسایی موتانت ها مجبوریم ازعامل انتخاب کننده استفاده کنیم تا سویه های موتانت را نسبت به آن جدا کنیم برای مشخص کردن خود بخودی یا عامل انتخاب کننده دو آزمایش بوسیله دانشمندان انجام شده :

  • آزمایش نوسانی
  • روش برداشت طرحی (Replica plate)
  • آزمایش نوسانی :

درکتاب نوشته شده است . حساسیت Ecoli را نسبت به باکتریوفاژ در دو لوله بررسی کرده

۲ – روش برداشت طرحی :

دراین روش یک پایه چوبی و بشر مانند را انتخاب می کنند دور این پایه چوبی را پارچه می بندند و سپس Ecoli را دریک plate بطور یکنواخت کشت می دهند واجازه رشد به آن می دهند تا مقداری باکتری روی پارچه گذاشته شود. علامتی را می گذارند تا مشخص شود در چه جهتی plate را روی پارچه می گذارند. سپس ۲ plate انتخاب می کنند . یکی حاوی استرپتومایسین و یکی فاقد آن . ابتدا plate فاقد استرپتومایسین را روی پارچه می گذارند تا برداشتی از باکتری ها روی پارچه روی ژلوز قرار گیرد.بعدازاین مرحله ژلوز حاوی استرپتومایسین را روی پارچه می گذارند تا برداشتی از باکتری ها روی پارچه روی ژلوز قرار گیرد . ۲۴ ساعت داخل گرمخانه می گذاریم تا باکتری رشد کند، در ژلوز فاقد استرپتومایسین باکتری به طور یکنواخت رشد می کند. اما در ژلوز حاوی استرپتومایسین فقط سویه های موتانت استرپتومایسین رشد می کنند بنابراین این آزمایش مشخص می کند که سویه های موتانت استرپتومایسین در کجا هستند. آن ناحیه را بر می داریم و مجدداً در ژلوز فاقد استرپتومایسین کشت می دهیم ( تکثیر سویه های موتانت،  مقاوم به استرپتومایسین ) و دوباره دریک پایه چوبی دیگری این کار را انجام می دهیم و مجدداً این کار را انجام می دهیم . اگر سه یا چهار بار این کار را انجام دهیم می توانیم سویه های مقاوم به استرپتومایسین را تکثیر کنیم.

با این آزمایش مشخص می شود موتاسیون پدیده طبیعی است ، همواره رخ می دهد و عامل انتخاب نقشی در موتاسیون ندارد و فقط بعنوان عامل انتخاب است . نقش انتخابی دارد نقش ایجادی ندارد.

مسئله دیگر، مسئله انتخاب طبیعی است . اگر تعداد مساوی از Ecoli وحشی لاکتوز مثبت و موتانت لاکتوز منفی داشته باشیم دریک محیط گلوکز دار کشت دهیم چون این دو می توانند ازگلوکز بطور یکسان استفاده کنند ، بطور یکسان هم رشد کرده و تعداد آن ها بصورت یکسان زیاد می شود . محیط گلوکز برای هر دو سویه حالت انتخابی ندارد ولی  هردو می توانند رشد کنند اما در مواقعی، محیط بدن، می تواند به نفع یکی از سویه ها عمل کند. اگر Ecoli که هم لاکتوز + و – است درمحیط لاکتوز کشت دهیم (مثلاً درمحیط مک کانکی) سویه وحشی لاکتوز + رشد کرده و بعد ازمدتی جای سویه های موتانت لاکتوز منفی را می گیرد وموتانت های لاکتوز منفی، حذف می شوند . انتخاب طبیعی دراین مورد در انتخاب سویه وحشی است و سویه موتانت ازبین می رود. اگر Ecoli را درمحیط حاوی پنی سیلین یا استرپتومایسین کشت دهیم سویه وحشی به استرپتومایسین حساس است در نتیجه  سویه وحشی از بین می رود و سویه موتانت رشد می کند چون  مقاوم به استرپتومایسین است به همین دلیل درمان نامناسب باعث می شود سویه های وحشی از بین رفته و موتانت های مقاوم باقی بمانند و درمان دچار مشکل شود.

اگر  باکتری پنوموکوک وحشی کپسول دار را درمحیط کشت ، کشت دهیم دراین  باکتری کپسول دار پنوموکوک معمولاً ۱۰۰ تا پنوموکوک موتانت بدون کپسول هست و میزان جذب غذایی درسویه موتانت بدون کپسول بیشتر از کپسول دار است . بنابراین بعد ازچند کشت چون میزان جذب کپسول دارها کمتراز بدون کپسول هاست در نتیجه باکتری های  بدون کپسول  رشد می کنند .اگر  سویه موتانت بدون کپسول را به بدن موش تزریق کنیم دراین  سویه موتانت بدون کپسول ۱۰۰ تا باکتری کپسول دار است . دربدن موش زنده این پنوموکوک بدون کپسول بوسیله ماکروفاژها ازبین می روند. اما آن ۱۰۰ تا باکتری موتانت برگشتی کپسول دار چون به فاگوسیتوز مقاومند دربدن موش مانده و رشد کرده ونهایتاً باعث مرگ موش می شوند در نتیجه دربدن موش برخلاف محیط کشت؛ برای سویه کپسول دار مناسب است.

این گونه انتخاب طبیعی در اکوسیستم های مختلف رخ می دهد . دستکاری نابجای انسان باعث رشد برخی سویه های خاص شده است.

درمورد برخی ازبیماری ها شخصاً ثابت شده که تأثیر گذار است . دربیماری سل که در حال افزایش است بیماری سل رادرانسان ناچار به درمان هستیم.  اما درمورد حیوانات درمان نمی کنیم و باید به کشتارگاه رود. برای درمان سل درانسان که طولانی مدت هم هست، حداقل باید ازدونوع آنتی بیوتیک، استفاده شود.

چندین ماه از استرپتومایسین + ایزونیازید استفاده می شود. اگر پزشکی اشتباه کند یا بیمار دستورات پزشک را به خوبی اجرا نکند چه حادثه ای رخ می دهد ؟  اگر درمان بیماری سل با یک آنتی بیوتیک شروع شود چه می شود ؟ برای مثال آنتی بیوتیک B,A را داریم. احتمال ایجاد مقاومت نسبت به یکی از این ها  است . پس از هر  باکتری ممکن است یکی ازآنها مقاوم شود . اگر پزشک فقط یکی ازآنتی بیوتیک ها را استفاده کند  باکتری ازبین می روند اما یک باکتری سل باقی می ماند که مقاوم به آنتی بیوتیک است . فرد ابتدا درمان می شود اما بعد از چندماه این باکتری مقاوم رشد می کند و مجدداً بیماری سل برگشت می کند. و مجدداً به پزشک رجوع می کند.

 

 

پزشک این بار ازآنتی بیوتیک دوم استفاده می کند. مجدداً حالت بالا پیش می آید و باکتری مقاوم می شود . مجدداً فرد خوب می شود اما پس از مدتی مجدداً برمیگردد . اما اینبار این باکتری به هر دو آنتی بیوتیک مقاوم است و اگر هردو آنتی بیوتیک را هم مصرف کند دیگر جواب نمی دهد و فرد می میرد. اگر هردو آنتی بیوتیک را با هم مصرف کنیم احتمال ایجاد مقاومت به این داده ها برابر می شود با  حاصل ضرب
=  که احتمال بسیار کمی است و عملاً ایجاد  باکتری در بدن وجود ندارد موتاسیون خود به خودی است اما درحالت های طبیعی و محیط های بکر این حادثه رخ داده اما درمحیط زندگی بشرو موجودات متأسفانه عوامل مختلفی وارد شده وتولید می شود که این عوامل شامل عوامل فیزیکی و شیمیایی هستند که عمدتاً عواملی اند که می توانند ایجاد موتاسیون کنند. این عوامل موتان زا باعث می شوند بصورت دستکاری شده و به صورت غیرخود به خودی ایجاد موتاسیون و یاخته های جهش یافته  شود . این عوامل را براساس مکانیسم عملشان به چند دسته تقسیم می کنند :

  • عوامل فیزیکی
  • عوامل شیمیایی

عوامل فیزیکی شامل  اشعه uv و اشعه x  ,گاما که دردستگاه ها و مواد مختلف ایجاد می شود. اشعه uv که منبع اصلی آن خورشید است یک اشعه موتان زا است . مکانیسم آن به گونه ای است که باعث اتصال بازهای پیریمیدین کنارهم به هم می شود و حلقه ای را ایجاد می کند که به آن سیکوبوتان می گویند یا دایمر پیریمیدین و باعث می شود C-C,C-T, T-T متصل شوند. وقتی این دو باز به هم وصل شدند در همانند سازی DNA نمی تواند دایمرها را شناسایی کند درنتیجه در زنجیر جدید موتاسیون انجام می شود. در ص ۳۶۶ کتاب این مسئله را مشاهده می کنید. اشعه های یون زا مثل x  وگاما قدرت نفوذ زیادی دارند به همین دلیل باعث شکستگی مولکول DNA می شوند. درنتیجه می توانند درمحیط رادیکال های آزاد ایجاد کنند که این رادیکال های آزاد درمولکول DNA اختلال و نقصان ایجاد می کنند.

عوامل شیمیایی :

این مواد شیمیایی که جزء لاینفک زندگی انسان شده است باعث ایجاد موتاسیون در یاخته ها می شود. یک دسته ازاین مواد شیمیایی ترکیباتی هستند مثل اسید نیترو، مواد آلکیلاتین، همچنین ترکیبات N دار. این مواد شیمیایی درمولکول DNA آدنین را تبدیل به هیپوگزاتین می کنند. A با T جفت می شود اما هیپوگزاتین مثل G عمل می کند. و با C جفت می شود بنابراین درزنجیره ی جدید به جای T ؛ G جفت می شود و باعث بروز موتاسیون می شود .

دسته دیگر مواد شیمیایی ، موادی هستند که تمایل زیادی نسبت به واکنش با DNA دارند . خودشان را دربین بازهای نوکلئوتیدی جایگزین می کنند. ازجمله رنگ هایی مثل اکریدین اورانژ، اکرین فلاوین، پروفلاوین، پس از جایگزینی دربین بازهای نوکلئوتیدی باعث تغییر ساختمان فضایی مولکول DNA می شوند در نتیجه باعث کاهش یا افزایش بازهای نوکئوتیدی درزنجیره جدید می شود .

دسته سوم مواد شمیایی، آنالوگ ها یا ترکیبات شیمیایی مشابه بازهای نوکلئوتیدی است . ازجمله اینها ۵ – برومواوراسیل  است که یک ترکیب شیمیایی مشابه بازهای نوکلئوتیدی است . اگر به فرم اصلی باشد با G جفت  می شود و به همین دلیل دررشته ی جدید به جای T ؛ G جایگزین می شود و این مسئله می تواند باعث ایجاد موتاسیون شود . ترکیبات شیمیایی مختلفی بصورت رنگ ها، حشره کش ها و آفت کش های مختلف تولید می شود و متأسفانه به راه های مختلفی وارد بدن موجودات و پروکاریوت ها می شود.

اکریل امید درروغن های زیاد سرخ شده ایجاد شده و سرطان زا است . برای مشخص کردن اینکه ماده شیمیایی موتان زا است یا نه باید آزمایشاتی انجام دهیم. درگذشته دراین آزمایشات ازحیوانات آزمایشگاهی استفاده می شد اما امروزه از باکتری ها برابر بررسی خاصیت موتان زایی مواد شیمیایی استفاده می کنند. ازباکتری سالمونلا تیفی موریوم S.Typhimurium استفاده می کنند که درمدت ۲۴ ساعت مشخص می کند که ماده شیمیایی خاصیت موتان زایی دارد یا نه.

سویه خاصی ازاین باکتری را انتخاب کردند که توانایی هیستیدین را نداشته باشد . درحضور میکروزوم ها یا عصاره کبد آن ماده شیمیایی را روی سالمونلا تیفی موریوم هیستیدین منفی آزمایش می کنند اگر دراین باکتری این ماده شیمیایی باعث ایجاد موتاسیون شد این باکتری  می شود و درمحیط رشد می کند ازاین جا مشخص می شود که این ماده شیمیایی موتان زا است . به این آزمایش Ames test می گویند ، چون آقای Ames این را اجرا می کرد. درباکتری ها مکانیسم های متنوعی وجود دارد. برای ترمیم ضایعات ناشی از موتاسیون (عوارض ناشی از موتاسیون باکتری ها راکمتر اذیت می کنند.) یکی ازعوامل موتان زا اشعه uv است. در باکتری ها پدیده هایی وجود دارد که ضایعات ناشی از uv را ترمیم می کند. یکی ازاین مکانیسم ها، مکانیسم ترمیم در روشنایی است light repair یا photoreactivetion که درطول موج مرئی این مکانیسم ترمیمی شروع به فعالیت می کند آنزیم هایی دخیل هستند به نام فتولیز که به صورت مستقیم پیوند دایمر پیریمیدین را حذف می کند .

بنابراین بازها به صورت مونومر در می آیند و موتاسیون ایجاد نمی شود. نوع دیگری ازمکانیسم ترمیمی درمورد اشعه uv ترمیم درتاریکی است darkrepair یا ترمیم برشی  exicision repair که مکانیسم پیچیده ای دارد که آنزیم های مختلفی درآن نقش دارند (در ص ۳۷۳ کتاب تصویر آن موجود است.)

آنزیمی به نام اندونوکلئاز ۲ طرف داریم پیرمیدین را برش می دهد تا این نوکلئوتید های به هم چسبیده را جدا کند . آنزیم دیگر به نام اگزونوکلئاز این شکاف را بیشتر می کند چون زنجیر. الگوی سالمی وجود دارد این شکاف به وسیله آنزیم DNA پلی مراز از روی زنجیر. الگوی سالم همانند سازی می شود و نهایتاً آنزیم DNA لیگاز این زنجیر. جدید تازه ساخته شده را به زنجیر جدید وصل می کند. مکانیسم ترمیم دیگر در رابطه با اشعه UV ترمیم متمایل به اشتباه است که بعداً توضیح داده می شود.

درباکتری ها آنزیم هایی بنام گلیکوهیدرولاز وجود دارد که انواع مختلفی دارد. وظیفه آنها این است که بازهای اشتباهی را از زنجیره جدید حذف کنند . فرضاً اگر U در زنجیره جدید جایگزین T شده توسط این آنزیم ها برداشته شده و توسط DNA پلی مراز بازمناسب قرار داده می شود. همینطور آنزیم های دیگری به نام AP آندونوکلئاز وجود دارد. این آنزیم ها نوکلئوتیدی های بدون باز را بر می دارد بنابراین ازایجاد موتاسیون جلوگیری می کند.

اما مکانیسم دیگر دررابطه با اشعه UV مطرح است وقتی نقشه ی سالم زنجیره سالم و طراحی دراختیار باکتری می باشد ازاین زنجیره برای برطرف کردن جهش ها و موتاسیون ها استفاده می کند اما اگر شدت اشعه uv شدید باشد بطوری که موتاسیون در دوزنجیر اتفاق بیفتد زنجیر طرحی سالمی وجود ندارد تا باکتری ازآن بعنوان الگو برای زنجیره آسیب دیده استفاده کند. دراین مواقع که درهر دو زنجیر. موتاسیون ایجاد می شود مکانیسم دیگری فعال می شود درباکتری ها بنام Erroprone repair یا ترمیم متمایلی به اشتباه . دراین مکانیسم متمایل به اشتباه باکتری برای اینکه زنجیره آسیب دیده را ترمیم کند و حتی لحظه ای زندگی کند و عمر بیشتری  داشته باشد بازها را به صورت غیرصحیح  دردوزنجیره آسیب دیده جایگزین می کند چون طرح مناسب و صحیح ندارد. این ترمیم را متمایل به اشتباه یا ترمیم si opous sit (SOS) می گویند (آخرین موسیقی مرگ)

 

 

روش های انتقال ژن :

شامل روش هایی است که برخلاف موتاسیون، تغییرات ناشی ازاین روش ها تغییراتی است که اطلاعات ژنتیکی ، خارج از اطلاعات ژنتیکی باکتری میزبان وارد باکتری می شود  و اطلاعات جدیدی را به ژنوم باکتری اضافه می کند. روش های مختلفی وجود دارد که اطلاعات ژنتیکی جدید به گنجینه ارثی میزبان و باکتری اضافه می شود یکی ازاین روش ها روش Transformation است.

اولین روش ژنتیکی شناخته شده است که درسال ۱۹۲۸ توسط آقای گریفیچ Grifficl انجام شد. آقای Grifficl روی ۲ سویه پنوموکوک ،سویه وحشی کپسول داری و سویه بدون کپسول غیرحاد درموش تجربه جالبی را انجام دارد به این ترتیب که :

  • پنوموکوک s : موش : مرگ : s

پنوموکوک s را به موش تزریق کرده مشاهده کرد که درموش باعث مرگ شده است و ازخون موش سویه وحشی s  را جدا کرد.

  • پنوموکوک s کشته : موش: زنده

پنوموکوک S کشته شده را به موش تزریق کرده و موش زنده ماند.

  • پنوموکوک R زنده : موش : زنده : R

پنوموکوک R را به موش تزریق کرد و مشاهده کرد که موشها زنده ماندند و از خون موش سویه بدون کپسول R را جدا کرد.

  • عصاره پنوموکوک کشته شده S + پنوموکوک R زنده : موش : مرگ : S

پنوموکوکS کشته شده را با سویه بدون کپسول غیرحاد R ترکیب کرد و به موش تزریق کرد و باعث مرگ موش شد اما درکمال ناباوری S زنده را از بدن موش جدا کرد.

در بررسی های انجام شده خود آقای Grifficl دلیلش را متوجه نشد اما بعداً مشخص شد که درعصاره پنوموکوک کشته اطلاعات ژنتیکی مربوط به ساختن کپسول به پنوموکوک R زنده منتقل شده و باکتری R زنده با ساختن کپسول باعث مرگ موش می شود این مسئله نقطه عطفی در بررسی های ژنتیکی بود . این روش ساده ترین روش انتقال ژن است . اما پدیده Transformation یک سری ویژگی ها، مشخصات و خواصی دارد که درسایر روش های انتقال ژن دیده نمی شود ازجمله این ویژگی ها :

  • دامنه وسعت و Rang ترانسفورماسیون است . به این ترتیب که پدیده ترانسفورماسیون درتعداد محدودی از باکتری ها رخ می دهد و درهمه باکتری ها به صورت طبیعی قابل انجام نیست . این باکتری ها شامل باکتری های خانواده باسیلوس، شیگلا، استرپتوکوک، هموفیلوس، ریزوبیوم ( دراثر انتقال اطلاعات ژنتیکی ازباکتری های ریزوبیوم به ریشه گیاه غده های محل تثبیت نیتروژن ساخته می شود) می باشد.

نیسریاها و باکتری های Agrobacterium tumefaciens که جز ریزوبیوم ها هستند دارای پلاسمین  می باشند و ازطریق همین پلاسمین  اطلاعات ژنتیکی بین باکتری و ریشه گیاه انتقال می یابد و توده های غده ای شکل درریشه گیاه حبوبات ایجاد می شود ازاین باکتری ها درمهندسی ژنتیک درتولید گیاهان بیوتکنولوژیک استفاده می شود.

  • ازخواص دیگر ترانسفورماسیون خواص قابل انتقال است . درباکتری هایی که پدیده ترانسفورماسیون درآنها اتفاق می افتد ، این عمل می تواند در مورد هر خاصیتی دراین باکتری ها رخ دهد ازجمله مصرف قندها، تولید برخی فراورده ها و .. دررابطه با فرکانس انتقال معمولاً فرکانس انتقال اطلاعات ژنتیکی یک درصد یعنی است.

به عنوان مثال اگر مقاومت به پنی سیلین را درنظر بگیریم احتمال انتقال مقاومت به پنی سیلین ازطریق ترانسفورماسیون  است. اما احتمال انتقال همزمان ۲ خاصیت با هم بستگی به جایگاه فیزیکی و محل این ژن ها دارد. اگر این ژن ها دور از هم باشند احتمال انتقال این ها همزمان با هم برابر است با حاصل ضرب احتمال هرکدام به تنهایی. مثلاً احتمال انتقال مقاومت به پنی سیلین و استرپتومایسین به طور همزمان برابر است با

 

احتمال انتقال درمورد ژن های نزدیک به هم بیشتر است مثلاً احتمال انتقال هم زمان مقاومت به استرپتومایسین و مصرف مانیتول به جای  است . این نشان دهنده این است که از نظر فیزیکی ژن این دو ویژگی در کنار هم یا نزدیک هم هستند.

  • خاصیت سوم حالت پذیرش است :

به این ترتیب که درباکتری های ترانسفورمه پذیر عمل ترانسفورماسیون درهمه شرایط رخ نمی دهد . این باکتری ها باید در شرایط فیزیولوژیک خاصی قرار بگیرند. این حالت خاص را حالت پذیرش یا Competence می گویند . دراین حالت پذیرگی پروتئین های خاصی به نام عوامل پذیرگی تولید می شود و دراین حالت است که فرکانس انتقال بالا است و از هر ۱۰۰ باکتری یک باکتری می تواند خاصیت جدید رادریافت کند. این حالت شبیه حالتی است که در دام ها دراثر تولید هورمون های جنسی در  حالت فحلی رخ می دهد.

مکانیسم ایجاد ترانسفورماسیون به این ترتیب است که پدیده ترانسفورماسیون درباکتری های نزدیک به هم معمولاً انجام می شود و قسمتی از ژنوم یک باکتری وارد باکتری میزبان می شود و درآنجا DNA دوزنجیره ای ، تک زنجیره ای شده (یکی از زنجیره های DNA ازبین می رود) و زنجیر باقی مانده درقسمتی ازژنوم میزبان که با این قطعه همسانی دارد و مشابه است جایگزین می شود . برای اینکه DNA وارد شده از باکتری دیگر در داخل باکتری میزبان ازبین نرود، داخل باکتری میزبان با pro خاصی ترکیب شده و حالت مجتمع تشکیل داده و نهایتاً در ژنوم باکتری میزبان جایگزین می شود. در تعدادی ازباکتری های ترانسفورمه پذیر این ژنوم وارد شده در داخل وزیکول هایی قرار می گیرند به نام ترانسفورموزوم، و در داخل این وزیکول ها نسبت به آنزیم های هضم کننده DNA میزبان می تواند حفظ شود و در ژنوم یاخته میزبان آمیخته شود.

پدیده ترانسفکیسون یا  Transfection پدیده ای مشابه Transformationاست که ناشی از انتقال اطلاعات ژنتیکی در حالت پذیرگی به باکتری ازطریق فاژ است ، در جریان این پدیده ، یاخته هایی که درحالت پذیرگی باکتری ها به وسیله اسید نوکلئیک جدا شده از باکتریوفاژ، عفونت می یابند و متعاقب آن باکتری می تواند باکتریوفاژ تولید کند.

پدیده الگوی که کار برد زیادی درانتقال ژن دارد پدیده fusion است یا پدیده جوش دادن ژن ها. دراین پدیده درحضور ترکیبات مثل پلی اتیلین گلایکون یاخته هایی که فقط دارای غشای سیتوپلاسیمی هستند را با هم مخلوط می کنند و جدار را در دو باکتری از بین می برند ، دراین حالت غشای ۲ باکتری به هم متصل می شود در برخی ازاین یاخته ها علاوه بر جوش خوردن غشاها ، اطلاعات ژنتیکی هم منتقل شده و جوش هسته ای هم اتفاق می افتد. یکی از راه های مهم انتقال ژن درمهندسی ژنتیک درتولید یاخته های  هیبرید یا بیوتکنولوژیک است و درواقع روشی است که برای تولید پادتن های تک بنیاتی یا آنتی بادی های مونوکلونال کاربرد دارد.

روش Electro poration روشی است که دراین روش انتقال ژن بااستفاده از منافذ یا پورهایی که درجدار باکتری ایجاد می شود انجام می شود. در واقع دراین روش به طور مصنوعی کار انتقال ژن را انجام می دهیم . دراین روش از دستگاه Electro poration استفاده می کنیم. این دستگاه در ولتاژ خاصی باعث می شود در جدار باکتری میزبان روزنه های ایجاد شود و ژن مورد نظر ازطریق این روزنه ها وارد باکتری می شود.

روش دیگر روش تفنگ  اسیدهای نوکلئیک است . درزیر میکروسکوپ و با استفاده از تفنگ های میکروسکوپی قطعات DNA را به داخل یاخته شلیک می کنند. روش دیگر انتقال ژن ازطریق ویروس های باکتریایی یا باکتریوفاژها است . باکتریوفاژها انواع مختلفی دارند و ساختمان آنها را در صفحه ۳۹۹ کتاب به صورت شماتیک مشاهده می کنید.باکتریوفاژ ازیک کپسید پروتئینی تشکیل شده که دارای قسمت رأسی است که ممکن است چند وجهی باشد و یک قسمت دمی همراه با زوائدی دارد . در داخل کپسید اطلاعات ژنتیکی فاژ قرار دارد.

باکتریوفاژها می توانند اطلاعات ژنتیکی را به میزبان های باکتریایی خاص خود منتقل کنند. بنابراین فازها ویژگی میزبانی دارند و هرکدام وارد باکتری خاص خود می شوند. برای ورود فاژ به داخل باکتری، فاژ باید به پذیرنده های خاص خود در سطح باکتری منتقل شود. درباکتری های گرم مثبت و گرم منفی انواع مختلفی از ساختارهای باکتریایی به عنوان پذیرنده فاژ عمل می کنند. ساختارهایی مثل کپسول، تاژک، فیمبریا سیدرفورها، اسیدهای تکوئیک، Pro های پرده بیرونی یا  درباکتری گرم منفی به عنوان پذیرنده فاژ عمل می کنند. Pro های پرده بیرونی انواع مختلفی دارند مثل ، ،  همچنین در باکتری گرم منفی LPS می تواند به عنوان پذیرنده فاژ باشد وقتی باکتریوفاژ وارد باکتری هدف شد، هدف اصلی آن استفاده از میزبان برای تکثیر است . بنابراین طی مراحل خاصی وارد باکتری شده و نهایتاً از آن خارج می شود .

  • جذب فاژی یا Adsorption : مرحله اول مرحله جذب است . دراین مرحله فاژ به وسیله قسمت دمی و آویزه های آن به پذیرنده های خود در سطح باکتری منتقل می شود. از قسمت دمی فاژ آنزیمی به نام آندولیزین آزاد می شود و باعث تجزیه آن قسمت از باکتری می شود . قسمتی دمی باکتریوفاژ به دلیل وجود pro هایی شبیه میوزین منقرض شده  و حالتی شبیه به سرنگ پیدا می کند.
  • Penetration یا نفوذ : دراین مرحله اسید نوکلئیک ژنوم فاژ به داخل سیتوپلاسم باکتری تزریق می شود.
  • Transcription یا رونوشت برداری: این مرحله مهم ترین قسمت پدیده انتقال ژن در باکتریوفاژ است و عمل رونوشت برداری براساس نیازهای تکثیرفاژ مرحله به مرحله انجام شده تا نهایتاً باکتریوفاژ کاملی را تولید کند. دراولین مرحله ژن های زودرس فوری یا Immediate early رونوشت برداری می شود . این ژن ها به وسیله RNA پلیمراز وابسته به DNA باکتری رونوشت برداری می شوند و شامل ژن هایی هستند که آنزیم های لازم برای انجام رونوشت برداری های بعدی را تولید می کند. ازجمله این آنزیم ها، آنزیم هایی است که ژن های دسته بعدی یعنی ژن های زودرس تأخیری یا Delayed early را رونوشت برداری می کند. این ژنها به وسیله RNA پلیمرازها رونوشت برداری می شوند. ژن های زودرس تأخیری ضمن تولید آنزیم های لازم برای همانند سازی DNA فاژ را تعیین می کنند RNA پلی مراز تغییر یافته دیگری را ایجاد می نماید که ژن های تأخیری را رونوشت برداری می کند.
  • آرایش جسمک های باکتریوفاژی و آزاد شدن آنها

انتقال ژن در باکتری ها : (Gene Transfer)

در باکتریها تبادلات ژنتیکی یا انتقال ژنها به روش های مختلفی انجام می شود. ما در موجودات عالی (جانوران و گیاهان) نر و ماده داریم که در واقع اسپرم یا تخمک اطلاعات ژنتیکی نر با ماده را ترکیب می کنند و نسل بعدی با اطلاعات ترکیبی  جدید ایجاد می شود . درگیاهان پرچم و مادگی وجود دارد که این کار را انجام می دهد. در انگلها عمدتاً کرمها، جرب ها و کنه ها نر و ماده دارند و تخم از ترکیب اسپرم با تخمک به وجود می آید . حتی در قارچ ها این مسأله وجود دارد. اما در باکتری ها به این صورتی که در موجودات عالی انتقال ژنتیکی از طریق اسپرم و تخمک انجام می شود وجود ندارد و تقسیم، یک تقسیم ساده است و بعداً یک باکتری بعد از مدتی بوسیله تقسیم به دو باکتری تبدیل می شود و اطلاعات ژنتیکی به همان صورت به نسل بعدی منتقل می شود. اگر چه در باکتری ها هم روش ها و مکانیسم هایی وجود دارد که ازطریق این روش ها اطلاعات ژنتیکی از باکتری به باکتری دیگر منتقل می شود.

اولین روشی که در انتقال ژن در باکتری ها مورد شناسایی قرار گرفت روش Transformation یا تغییر ناشی از انتقال (تبدیل گری = ترانسفورماسیون) بود. درسال ۱۹۲۸ م آقای گریفیچ Griffich در پنوموکوک کپسول دار و بدون کپسول این پدیده را مشاهده کرد. استرپتوکوک پنومونیه ( پنوموکوک) به دو صورت S یا حاد یا بیماریزا یا وحشی کپسول دار و R یا غیر حاد یا بدون بیماریزا یا بدون کپسول دیده می شود. اگر این باکتری را به موش بزنیم (سویه حاد یا S) باعث مرگ موش می شود. اما اگر سویه R را به موش تزریق کنیم موش سالم باقی می ماند. آقای گریفیچ نبوغی که به خرج داد این بود که پنوموکوک S کشته شده را با R زنده مخلوط کرد و به موش تزریق کرد، موش مرد و از موش سویه S (کپسول دار وحشی) را جدا کرد. خود آقای گریفیچ متوجه این قضیه نشد که به چه نحوی سویه S کشته شده در موش زنده شده است. اما بعداً مشخص شد که در اثر مخلوط کردن R زنده با s کشته شده انتقال ژنتیکی انجام می شود و ژن کپسول به سویه R زنده منتقل می شود و آن را ترانسفورمه می کند و کپسول دار می کند و سویه S را از بدن موش جدا می شود.

پدیده ترانسفورماسیون پدیده ای است که در واقع دراثر انتقال ژن از یک عصاره کشته شده به باکتری زنده رخ می دهد نیازی نیست که دو باکتری زنده باشد. پدیده ترانسفورماسیون پدیده ای است که بصورت طبیعی در معدودی از باکتریها مثل پنوموکوک، باسیلوسها، نیسریاها،هموفیلوسها، ریزوبیوم ها انجام می شود و درهمه باکتریها عمومیت ندارد. حتی بین باکتریها و ریشه برخی از گیاهان بخصوص گیاهان تیره حبوبات (نخود، لوبیا، سویا، یونجه، عدس) انجام می شود.

ژن باکتری در ژنوم ریشه گیاه وارد می شود و یک حالت پرولیفراسیون ایجاد می کند که نتیجه این کار ایجاد غده است که محل تثبیت نیتروژن هواست و برای گیاه بسیار ضروری است . عمل ترانسفورماسیون به صورت آزمایشگاهی هم اتفاق می افتد و آن حالتی است که در حضور موادی مثل پلی اتیلن گلیکول جدار یاخته ای را ازبین می برند و یاخته های بدون جدار که فقط دارای غشاء سیتوپلاسمی هستند با هم مخلوط می کنند و دربعضی از این یاخته ها عمل امتزاج ( جوش خوردن یا Fusion بین غشاء ها و هسته و DNA اتفاق می افتد که باعث انتقال ژنتیکی در یاخته می شود. ازاین پدیده جوش خوردن برای تولید هیبریدوما در تولید آنتی بادیهای مونوکلنال یا تک بنیانی استفاده می کنند.

پدیده ترانسفکشن (Transfection)

پدیده ای است که در واقع در اثر انتقال ژن از باکتریوفاژ به باکتری رخ می دهد. در پدیده ترانسفورماسیون برای اینکه باکتری پذیرنده ژنوم جدید را بگیرد باید دریک شرایط فیزیولوژیک خاص قرار بگیرد که به این شرایط خاص حالت پذیرگی یا competence می گویند. (شبیه حالت مخلی در دامهاست) . دراین حالت ژن باکتریوفاژ می تواند وارد باکتری پذیرا بشود. در دنیای میکروبی و درکنار آنها باکتریوفاژ داریم و پدیده هایی مثل جوش خوردن، ترانسفکشن و … رخ می دهد.

پدیده ترانسفکشن انتقال ژن از طریق فاژها یا باکتریوفاژهاست.

باکتریوفاژها ویروسهای هستند که می توانند از طریق پذیرنده های خاصی که در سطح باکتریهاست وارد باکتری خاصی بشوند. این پذیرنده معمولاً در سطح باکتریها وجود دارد و مربوط به LPS ، پپتیدگلیکان، اسیدتیکوئیک، فیمبریه و پروتئین پرده بیرونی (OMA) و پرده خارجی است ، که باکتریوفاژها ازطریق اینها وارد باکتری می شود. به همین دلیل هر باکتری، باکتریوفاژ یا باکتریوفاژهای خاص خودش را دارد. باکتریوفاژ پس از ورود به میزبان باکتریایی می تواند دو مسیر طی کند:

یا زنوم و ساختار باکتریایی را دراختیار خود قرار می دهد و شروع به تکثیر می کند، بعضی بعد از مرحله جذب ژنهای زودرس  نوری، ژنهای زودرس تأخیری و ژن های تأخیری را رونوشت برداری می کند و ژنوم ویروسی را همراه با کپسید تولید کرده و تکثیر پیدا می کنند. باکتریوفاژها سر و د می دارند که از طریق دم به یاخته های پذیرنده متصل می شود، وقتی باکتریوفاژ وارد میزبان باکتریایی شد بعد از دوره محاق تکثیر پیدا می کند. این تکثیر در بعضی از ویروسها فعال است و نهایتاً بعد از تولید ۱۰۰ تا ۲۰۰ ویروس باعث تخریب باکتری میزبان می شود. این باکتریوفاژها را باکتریوفاژ حاد یا Virulrnt phage laytic phage   (باکتریوفاژهای کشنده ) می گویند یا به اصطلاح میهمان میزبان کش، چرخه تکثیری این فاژها کامل است .

اما نوع دیگری از تکثیر فاژ وجود دارد که درآن فاژ در ژنوم میزبان باکتریایی آمیخته می شود و جزیی از ژنوم میزبان می شود (میهمان میزبان شده) . اینگونه فاژها را فاژهای معتدل Temperate phage یا فاژهای لیزوژنی lysogenic phage می گویند. چرخه تکثیر این فاژها کامل نیست ، بنابراین با میزبان کاری ندارند و همراه با آن تکثیر پیدا می کنند. و نسل های بعدی این ژن ها را دارند. ژن باکتریوفاژ کاملاً با ژن باکتری الحاق پیدا کرده است و Recombination اتفاق افتاده است و با تکثیر باکتری ژن باکتریوفاژ ازم ادر به سلول دختری منتقل می شود. گاهی اوقات ممکن است این فاژ معتدل از حالت لیزوژنی خارج شود و به حالت فاژ حاد یا لایتیک در بیاید. دراین حالت انتقال ژنتیکی می تواند رخ دهد. این فاژ (پروفاژ prophage یا حالت لیزوژنی ) ممکن است به وسیله و به علت عوامل مختلفی از حالت لیزوژنی در بیاید و کنده شود و به داخل سیتوپلاسم وارد شود منتهی همراه خود ممکن است قطعاتی از ژن باکتری را داشته باشد مثل ژن مصرف لاکتوز، یا ژن مقاومت به آمپی سیلین. وقتی این فاژ از باکتری خارج شد و وارد میزبان دوم باکتریایی شد می تواند این ژن جدید را به میزبان دوم منتقل کند. این حالت را ترانسداکشن یا ترانسدوکسین (Transduction) می گویند.

اما بعضی مواقع فاژ خودش ژن های خاصی دارد که وقتی وارد باکتری میزبان می شود یک صفت ژنتیکی جدیدی را به باکتری اضافه می کند. مثلاً در کورینه باکتریوم دیفتری فاژی به نام فاژ  وجود دارد. این فاژ وقتی وارد باکتری می شود ژنوم فاژ در ژنوم کورینه باکتریوم آمیخته می شود و ویژگی تولید سم دیفتری را به باکتری می دهد. ژن مربوط به زهرابه دیفتری مربوط به خود باکتری نیست و مربوط به فاژ  ایی است که در داخل باکتری الحاق و integred می شود. این پدیده را اصطلاحاً کونورسیون conversion می گویند. علاوه بر این مثال در مورد تعدادی از باکتریها هم تولید سم، تولید پروتئین، آنزیم ، آنتی ژن ها به وسیله کونورسیون که درآن فاژ هم حامل ژن و هم صاحب ژن است، اتفاق می افتد. اگر حضور فاژ همراه با بروز خاصیت جدیدی باشد به آن کنورسیون مثبت می گویند اما در برخی از باکتریها مثل استاف آرئوس حضور فاژ باعث عدم تولید برخی از آنزیم ها می شود، مثلاً در حضور فاژ آنزیم لیپاز،  توکسین، لاتوکسین تولید نمی شود. این حالت را اصطلاحاً کتورسیون منفی می گویند.

روش دیگر انتقال ژن از طریق Sexuality یا conjugation یا کونژوگه یا جفت گیری و جنسیت است . اما جنسیت که در باکتریها مدنظر است با جفتگیری و جنسیت موجودات عالی است تفاوت دارد به این ترتیب که در باکتری ها برخلاف یاخته های یوکاریوتیک عوامل ژنتیکی خارج کروموزومی وجود دارد که به آنها پلاسمید (plasmid) می گویند.

پلاسمیدها انواع مختلفی چه بصورت طبیعی و چه بصورت دست ساز دارند. عوامل خارج کروموزومی هستند که در انتقال ژن دخیل هستند. معمولاً چندین ژن دارند، ژن های مربوط به انتقال، ژن های مقاومت به آنتی بیوتیک ها، مصرف برخی از قند ها مثل لاکتوز، پلاسمیدها مولکول های حلقوی بسته ازDNA هستند. دارای ژن های مختلف هستند، پلاسمیدها را معمولاً به این صورت نام گذاری می کنند : pBR322 . اول p کوچک که اول حرف پلاسمید است می نویسیم بعد حروف وسط حروف اول اسامی کسانی هستند که پلاسمید را جدا کرده اند و شماره ای که در انتها است شماره ای است که بصورت دلخواه توسط محقق به پلاسمید داده شده است . مثلاً پلاسمید Pbr 323 که p حرف اول پلاسمید plasmid است B حرف اول اسم بولیوار Bolivar و R حرف اول اسم رودریگوئز Rodriguez است که این دو افرادی بودند که این پلاسمید را جدا کردند و ۳۲۲ شماره ای است که به دلخواه توسط دو محقق به پلاسمید داده شده است . پلاسمید Pbr322 حدود ۴۶۲۱bp  طول دارد که مقاومت به آمپی سیلین و تتراسایکلین را دارد و پلاسمید بسیار مهی است .

ممکن است برپایه این پلاسمید اصلی پلاسمیدهای دیگری هم تهیه بشود. مثلاً از پلاسمیدpBR 322  پلاسمید دیگری ساخته شده به نام Pbr 325 که ژن مقاومت به کلرامفنیکل را نیز دارد. مشخصات این پلاسمیدها در اینترنت و بروشورهای شرکت سازنده در اختیار ما قرار می دهد وجود دارد.

یکی از پلاسمیدهایی که در انتقال ژن دخالت دارد پلاسمید F یا پلاسمید Fertility یا پلاسمید باروری PF است. این پلاسمید ساختمان خاصی دارد و دربرخی از باکتری ها وجود دارد. و برخی از این باکتری ها این پلاسمید را ندارند. باکتری که دارای پلاسمید F است را باکتری نر یا  می گویند و باکتری که فاقد این پلاسمید است را باکتری ماده یا  می گویند. این باکتری نر می تواند پلاسمید F را به باکتری ماده که پلاسمید F را ندارد منتقل کند. بنابراین باکتری  می تواند به باکتری  آمیخته شود و باکتری ماده را تبدیل به باکتری نر بکند. این عمل را جنسیت یا جفتگیری می گویند. معمولاً باکتری های نر فیمبریه های جنسی دارد ( ۲تا۳ عدد ) که ژن های مربوط به این فیمبریه جنسی در داخل pF است . این pF همراه خود ژنهای دیگری نیز ممکن است داشته باشد مثل مقاومت به آنتی بیوتیک ها، مصرف بعضی از ترکیبات وقندها یا بیوسنتز برخی از اسیدهای آمینه را داشته باشد ( حدود ۷ الی۱۰ ژن را می تواند با خود حمل کند ) و وقتی وارد باکتری ماده شد می تواند این ویژگی های جدید را در باکتری القاء کند. فرق جنسیت با روش های قبل این است که بایستی حتماً دوباکتری زنده باشد و معمولاً بین آنها باید تماس فیزیکی برقرار شود.البته فراوانی یا فرکانس انتقال این پلاسمید F و ژن های همراه در باکتری نر متفاوت است . به همین دلیل یکدسته از این باکتری های نر را  HFr (High Frequency of recombination) می گویند. یا باکتری های نری که با فراوانی بالا ژن ها را منتقل می کند. علت این است که این پلاسمید F بعضی مواقع در داخل ژنوم قرار می گیرد ، بعد که در داخل ژن باکتری قرارگرفت بریده می شود و بیرون می آید و به همراه خود قسمتی از ژن باکتری را دارد و وقتی وارد باکتری ماده شد اکثر باکتری های ماده ژن جدید را می گیرند ولی تعداد کمی از آنها نر می شوند . چون پلاسمید F به طور کامل وارد نمی شود . اما در باکتری نر  پلاسمید F بطور کامل به باکتری ماده وارد می شود که معمولاً همراه خودش ژن های جدید ندارد. به همین دلیل اکثر باکتری های ماده، نر می شوند ولی تعداد کمی ازآنها ژن های جدید را می گیرند. حد واسط بین باکتری های  و HFr باکتری های نری هستند که به آنها َ F می گویند که این باکتری های نر َ F هم الحاق ژنتیکی بالایی دارند و هم اکثر باکتری های ماده ، نر می شوند.

راه های دیگر انتقال زن وجود دارد ، یکی ازآنها انتقال ژن از طریق ردیف های جایگزینی Insertion Sequences یا (IS) می گویند. ردیف های جایگزین قطعات ژنتیکی هستند که می توانند از یک پلاسمید به کروموزوم باکتری یا ازیک قسمت از کروموزوم باکتری به قسمت دیگر کروموزوم متصل و جابجا بشوند. قطعات کوچکی هستند که این مسأله باعث می شود که امکان و احتمال جابجایی آنها راحتتر باشد. معادل همین ردیف های جایگزینی بنیانهای جابه جای شدنی یا ترانسپوزومها Tn (Transposone) هستند. ترانسپوزوم ها می توانند از قسمتی در کروموزوم به قسمت دیگر کروموزوم، از پلاسمید به کروموزوم و یا برعکس منتقل شوند. درآزمایشگاه از این روشها برای کلون کردن، برای آمیخته گری (PCR coloning kit) و تولید یاخته های هیبرید جدید، باکتری های با ژنوم جدید واستفاده ازآنها برای فرآورده های بیوتکنولوژیک استفاده های زیادی می کنیم. اما با توه به جمعیت فوق العاده زیاد میکروبی که درآزمایشگاه درمحیط کشت و اکوسیستم های مختلف می بینیم و باهم در تلاقی هستند. انواعی از این روش ها ممکن است درآنها رخ دهد. ولی این تغییرات و تبادلات ژنتیکی دریک حد محدودی است و اگر بصورت وسیع و گسترده رخ بدهد ، در مدت زمان کمی ساختار ژنومی و ساختار کلی باکتریها وبسیاری از باکتری ها ممکن است تغییر پیدا کند.

اما مشاهده می شود که تغییرات در باکتریها در طی سالها محدود است . مثلاً E-coli ۱۲۰ سال پیش با Ecoli امروز تفاوت زیادی ندارد و تفاوت نقطه درچند ژن است (مقاومت به یک آنتی بیوتیک است، مثلاً قبلاً به این آنتی بیوتیک حساس بوده اما الان مقاوم شده است) علت این مسأله این است که در داخل باکتریها سیستم های دفاعی خاصی وجود دارد که جلوی این تغییرات ژنتیکی را می گیرد. بنیان هرموجودی ژنوم آن موجود است. اگر این ژنوم دچار تغییر شود ماهیت آن موجود هم تغییر می کند. به این سیستم دفاعی پدیده Restriction and Modification (  یا پدیده تغییر محدودیت می گویند .

در پدیده  آنزیم های مختلفی دخالت می کنند تا DNA خارجی وارد DNA خودی نشود. در پدیده های انتقال ژن که گفته شد این انتقال ژن ها بین باکتریهای نزدیک به هم رخ می دهد . یعنی مثلاً پنوموکوک R  ژن کپسول را از پنوموکوک S کشته شده می گیرد و تفاوت آنها در یک ژن است و این ژن مثلاً به Ecoli منتقل نمی شود. یا انتقال ژن بین باسیلوسها یا بین دو باکتری هموفیلوس آنفلوآنزاست یا درمورد جنسیت، دو Ecoli نر و ماده ژنوم را با هم منتقل می کنند. یا باکتریوفاژ خاصی میتواند وارد یاخته Ecoli یا سالمونلا بشود و ژن مربوط به پادگن  را ایجاد کند. اینها در طول تکامل قرابت های ژنتیکی بین خودشان ایجاد کرده اند و یک سازگاری ژنتیکی درمورد اینها رخ داده است و وقتی ژنوم خارجی وارد میزبان می شود در قسمتی از ژنوم میزبان که همولوژی (مشابهت) بالایی با آن دارد وارد می شود ( اگر این همولوژی نباشد قطعاً این جایگزینی اتفاق نمی افتد و ژن تثبیت نمی شود و تکثیر نمی یابد)

همین مسأله باعث می شود که دانشمندان به این فکر بیفتند که انتقال ژنتیکی به چه نحوی رخ می دهد ؟ درجمعیت های انسانی و درکشورهای مختلف برای شناسایی افراد آن کشور و تشخیص آنها از افراد بیگانه از گذرنامه استفاده می کنند و در مرزهای ورودی ویزای ورود خواسته می شود. درمورد باکتریها هم سیستم  همچنین کاری را انجام می دهد. به این ترتیب که در پدیده  دو تا پدیده درکنار هم عمل می کنند، تا ژنوم یاخته دچار تغییر نشود.

پدیده اول Modification است. به این ترتیب که در پدیده تغییر یا اصلاح Modification آنزیم های به نام متیل آز می آید DNA خودی را رمز گذاری می کند. عمدتاً در محل های آدنین یا سیتوزین، این آنزیم متیلاز در محل های خاصی به آدنین و یا سیتوزین متیل ( ) اضافه می کند و آدنین را تبدیل به N – ۶- متیل آدنین می کند یا سیتوزین را تبدیل به ۵- متیل سیتوزین می کند. در نتیجه DNA خودی را در جایگاه های خاصی رمز گذاری یا مدیفاید یا تغییر پیدا می کند. این متیل در واقع رمز ژنتیکی است اما DNA ی که از خارج وارد می شود رمز های متفاوتی نسبت به DNA  خودی دارد. متیل آز DNA خارجی نوع دیگری است و درجایگاه های متفاوتی رمز گذاشته است. این متیل در واقع اسم شب یا ویزا  است . اساس تشخیص DNA خودی از غیر خودی جایگاه های متیله شدن آدنین و سیتوزین است.

درکنار این آنزیم متیل آزو سیستم Modification سیستم دیگری در یاخته ها فعال است به نام سیستم تعیین حدود یا Restriction . این سیستم مثل گشتی های بازرسی است . اساس پدیده تعیین حدود آنزیم هایی است به نام Restrication Endonuclese یا آنزیم های RE است . این آنزیم ها بر روی سلول گردش می کنند و اگر DNA ی وجود داشته باشد که در جایگاه های خاص متیله نشده باشند آن DNA را از بین می برند.

خطرناکترین دشمن خود DNA است چون می خواهد ماهیت موجود را عوض کند ، بنابراین این RE ها DNA های خارجی را تخریب می کنند به همین دلیل است که عمل انتقال ژن در اکثر مواقع موفقیت آمیز نیست و در شرایطی در باکتری های تغییر یافته یا دست ساز و یا باکتری های شبیه به هم این عمل اتفاق می افتد. این آنزیم های Restriction سه نوعند : .

آنزیم های تعیین حدودی  و  اهمیتی زیادی ندارند و کمتر از آنزیم  اهمیت دارند. چون واکنش و فعالیت آنزیم های  و  گرما زا نیست و بنابراین نیاز به ATP و انرژی دارد در صورتیکه آنزیم های  واکنش گرمازاست و نیازی به تأمین انرژی ندارد و مورد دیگر این است که محل برش و محل شناسایی تایپ  با هم متفاوت است به این ترتیب که آنزیم های نوع  سایت برش آنها حدود ۲۶ جفت باز از سایت شناسایی فاصله دارد. سایت برش  با سایت شناسایی حدود ۱۰۰۰ باز از هم فاصله دارند بنابراین ازاین دو آنزیم در تکنولوژِ زیاد استفاده نمی شود. اما آنزیم های  اهمیت دارند و در مهندسی ژنتیک و در کلونیگ استفاده بالینی دارند.

آنزیم های Restriction بیشتر از باکتریها جدا شده اند و بیش از ۲۰۰ نوع آنزیم تعیین حدودی از باکتری های مختلف جدا شده است . معروفترین آنزیم تعیین حدودی که کاشف آن جایزه نوبل گرفت آنزیم  است. نامگذاری این آنزیم ها براساس باکتریهایی است که این آنزیم ها از آنها جدا و استخراج شده است و به این ترتیب که حرف اول اسم آنزیم که بزرگ نوشته می شود. از حرف اول اسم جنس باکتری گرفته می شود ( E= Esherchia) دو حرف بعدی گونه را ذکر می کند که به صورت حروف کوچک نوشته می شود (co- coli) و سپس اسم سویه یا شماره سویه را ذکر می کنند. (  سویه ) . آنزیم دیگری است به نام  که B آن از باسیلوس گرفته شده است am از amiloliquefacions گرفته شده و سویه  است . و یا آنزیم  که H از هموفیلوس،  از  گرفته شده است . ۲۰۰ نوع ازاین اسامی را داریم Restriction , Modifaid سایت شناسایی یا محل برششان در جایگاه خاصی است . این جایگاه های شناسایی عمدتاً ردیف های بازی ۴ تا ۶ بازی هستند که از ۲ طرف اگر اینها را بخوانیم یکسان خوانده می شوند. این ردیف ها را ردیف های پالیندرومی palindromic seqeuences یا ردیف های بهرطویل یا تقارن دوطرفه می گویند. آنزیم های تعیین حدودی تیپ  محل شناسایی و محل برششان نزدیک به هم است . عمل برش این آنزیم ها به دو صورت انجام می شود. این آنزیم ها یا کج بُر هستند (Staggered cut) و یا راست بُر یا مستقیم بر هستند.

به این ترتیب که آنزیم های مثل  به این صورت است که سایت R & B آنها این ردیف پالندرومیک است G AA TT C                                                                                 

C TTAA  G

اما آنزیم های  مثل  آنزیم های راست بر هستند و سایت شناسایی آنها بازی است و به صورت  روبه رو است :                                                                          GG CC

   CC GG

 اما در بیولوژی مولکولی عمدتاً از آنزیم های کج بُر مثل آنزیم های   یا   استفاده می شود . بخاطر اینکه دراین کج برها انتهای چسبناک ایجاد می شود.

Escherchia coli  ) (

G AA TT C                                 -G     AATTC-

 C TT AA G                          -C TTAA           -G                  

Bacillus amiloliqueficiens   )  (

GATCC-                    -G                   G GATCC                                

G-                           -CCTAG                                         CC TAGG    

Haemophilus aegypticus              

                             GG CC                  -GG            CC-

                              CC GG                                                            -CC               GG-

 

بنابراین در کلون کردن ما می آییم ژن مورد نظر را که می خواهیم کلون کنیم و پلاسمید حامل را با یک آنزیم  برش داده و چون آنزیم مشابه است سایت و محل برش مشابه است . بعداً قطعات این ژن مورد نظر را با حامل مخلوط می کنیم و بصورت تصادفی در تعدادی از این پلاسمیدها قطعه ژن مورد نظر جایگزین می شود و یک پلاسمید آمیخته ای یا لیگاتور شده ای ایجاد می شود (ژن یک ویروس یا باکتری با تولید انسولین) بعداً این پلاسمید را وارد یک میزبان می کنیم که پروکاریوت یا یوکاریوت است . این میزبان باکتریایی یا مخمر کارخانه تکثیر پلاسمید یا ژن مورد نظر ماست که اگر مسیر مناسب باشد آن ژن داخل باکتری یا مخمر ساخته می شود و باکتری یا مخمر آن ژن مورد نظر ما را خواهند ساخت.  اما درمورد آنزیم های راست بر؛ قطعات ایجاد شده قطعات با انتهاب غیرچسبناک (non sticky End,Blunt end , Flushend ) هستند به این دلیل احتمال چسبیدن ضعیف است و درمهندسی ژنتیک ازاین آنزیم ها استفاده نمی شود.

کاربرد دیگر آنزیم های تعیین حدودی استفاده از آنها در روش مولکولی Finger Printing  (انگشت نگاری ) است ما براساس این آنزیم ها انگشت نگاری مولکولی می کنیم . به این ترتیب که ما می توانیم با استفاده از این آنزیم ها DNA را برش دهیم و DNA های برش داده شده را با هم مقایسه کنیم یا قطعاتی که در PCR تکثیر کرده ایم را با این آنزیم ها برش می دهیم و با هم مقایسه می کنیم. قطعاً اگر ژنوم های مورد بررسی مشابه باشند قطعات ایجاد شده هم مشابه خواهند بود .فرض کنید زن Spr که امروز کلون شد را برای ۵۰ سالمونلا که PCR کردیم با آنزیم  برش می دهیم. این ژن های ۵۰ تا سالمونلا اگر مشابه باشند به وسیله این  در دو جای مشابه برش داده می شود و بنابراین قطعات مشابه تولید می کنند.

                         ۴۲۰ bp SPr                                                                                                       

دو قسمت                                  ۱۵۰  bp                                            

                                      ۲۷۰ pb                                       

به داخل ژل برده و  RUN  می کنیم     

در تعیین نسبت خویشاوندی در انسان و برای تشخیص برخی بیماریها نظیر کم خونی ها نیز از این روش استفاده می شود. این روشها که روشهای مطمئنی هستند را اصطلاحاً   Restriction Fragment lengh polymorphism (RFLP ) می گویند. یکی از روش های خوب انگشت نگاری مولکولی است . انگشت نگاری روش های مختلفی دارد مثل RAPD که از پرایمرهای کوچک و هگزامر ۶- ۱۰ تایی استفاده می شود . روش RFLP ، روش PFGE و روش Sequencing از دیگر روش های انگشت نگاری مولکولی هستند.

تنظیم نمود ژن Regulation of Gene expression

ما در باکتری ها بطور متوسط حدود ۴۵۰۰ تا ژن داریم ( در باکتری مثل E coli) اما این ۴۵۰۰ ژن همواره فرآورده هایشان مورد نیاز باکتری نیست، حدود ۱۰۰۰ ژن هستند که همواره فرآورده هایشان مورد نیاز باکتری است و بقیه ژن ها حدود ۳۵۰۰ تا در مواقعی که مورد نیاز است فرآورده هایشان بروز می یابند. آن چیزی که درهمه موجودات مهم است بروز چیزی است که ژنومش نهفته است تا که یک عملکرد در آن بروز کند. اما درمورد باکتریها حساب و کتاب بسیار دقیق است . باکتریها بسیار عاقلانه  و منطقی کارشان را انجام می دهند به این ترتیب که در موقعی که به فرآورده ژنی نیاز ندارد انرژی مصرف نمی کند برای تولید آن فرآورده و انرژی را صرف رونوشت برداری و پروتئین سازی می کند. بنابراین ژن ها را به دو دسته تقسیم کرد :

  • ژن های همیشه سازنده : ژن هایی که همیشه فرآورده هایشان ساخته می شوند.
  • ژن های انگیزه پذیر : که در مواقعی که انگیزه وجود داشته باشد این ژن ها بروز می کنند و زمانیکه آن انگیزه وجود ندارد این ژنها خاموش هستندو فعالیتی ندارند.

مکانیسم های مختلفی برای تنظیم نمود ژن و کنترل و تنظیم نمود ژن وجود دارد. یکی از این مکانیسم ها :

 

۱) Operon Lactose ( اپرون لاکتوز)

قندی مثل لاکتوز که بعنوان سوبسترا و انگیزه (inducer) برای استفاده در باکتریE coli  لازم است که آنزیم های مربوط به متابولیسم لاکتوز تولید شود و یک مسیر چند آنزیم است تا لاکتوزی که در محیط است وارد باکتری شود و در باکتری مورد استفاده قرار گیرد و ATP  تولید شود. حداقل سه آنزیم در متابولیسم مصرف لاکتوز نقش دارد :

  • آنزیم لاکتوز پرمتاز که باعث می شود لاکتوز از محیط وارد باکتری شود ژنی که این پروتئین را رمز می کند ژنی است به نام Lacy
  • آنزیم بتاگالاکتوزیداز : به وسیله ژنی به نام LacZ کد می شود و لاکتوزی را که وارد سلول شده است را با گالاکتوز و گلوکز تجزیه می کند.
  • آنزیم گالاکتوزید ترانس استیلاز که مسئول استیله کردن گالاکتوز است یا ورود به متابولیسم استیله شدن و ژنی که این پروتئین را رمز می کند ژن LacA است.

اگر باکتری E coli را درمحیط لاکتوز دار کشت دهیم برای اینکه باکتری از قند لاکتوز محیط بتواند استفاده کند نیاز دارد تا این سه آنزیم را به همراه هم و با هم تولید کند ( اگر یک آنزیم را تولید نکند هم حتی بدرد مصرف لاکتوز نمی خورد) . یا این سه آنیزم را با هم تولید می کند و یا هیچکدام را تولید نمی کند. بنابراین باکتریها هدفمند کردن تولید آنزیم ها را انجام می دهند. درواقع کار باکتریها هماهنگ کار کردن و اپرایی کار کردن و تنظیم کردن است . دراین روش یا آنزیم ها تولید می شوند یا ساکت هستند. در مورد این سه تا ژن هم اینگونه است و تولید ژن و عدم تولید آنها تحت کنترل ژن دیگری است به نام ژن Lac I یا ژن inhibitory . این ژن تنظیم کننده ، ماده ای تولید می کند به نام ماده ممانعت کننده یا Represor. ماده ممانعت کننده ۲ تا جایگاه دارد. یک جایگاه برای اپران و یک جایگاه برای لاکتوز ، لاکتوز به جایگاه دوم متصل می شود.

Re

ممانعت کننده

Re

 

 

                                                                   

                        لاکتوز

هررشته ژنی دارای یک پروموتور است . پروموتور جایگاهی است که آنزیم RNA پلی مراز وابسته به DNA به آنزیم وصل می شود و شروع به رونوشت برداری از ژنها در نتیجه تولید mRNA می کند.

Lac A  Lac Y Lac Z  promoter Lac  

 

قبل از پرموتور ژن تنظیم کننده وجود دارد که  است.  حالت همیشه سازندگی دارد و همیشه روشن است و ماده ای تولید می کند به نام ماده ممانعت کننده یا Represor و این ماده همواره ساخته می شود. این ماده ممانعت کننده ۲ تا جایگاه دارد یکی برای اتصال به پروموتور اوپرون لاکتوز و دیگری جایگاه برای اتصال قند لاکتوز. موقعی که باکتری را درمحیطی که لاکتوز نیست کشت دهیم و گلوکزدارد، این ماده ممانعت کننده می آید به پروموتور اوپرون لاکتوز وصل می شود و وقتی وصل شد یک دیواری ایجاد کرده و مانع از اتصال آنزیم RNA پلی مراز وابسته به DNA می شود در نتیجه آنزیم وصل نشده و ژن های رونوشت برداری نمی شوند، اما اگر E coli را درمحیطی که لاکتوز یا انگیزه است کشت دهیم، این لاکتوز به جایگاه دوم ماده ممانعت کننده وصل می شود و باعث میشود که شکل فضایی ماده ممانعت کننده به نحوی تغییر کند که نتواند به پروموتور اوپرون لاکتوز وصل شود دراین صورت آنزیم RNA پلی مراز به محل وصل شده و ژن ها را رونوشت برداری کرد. و mRNA ساخته می شود و به سطح ریبوزوم رفته و این پروتئین ها و آنزیم ها ساخته می شوند.

مکانیسم تنظیمی دیگر مکانیسم مهار تولید اسیدهای آمینه است که به صورت Feed back عمل می کند. در مکانیسم تنظیمی سنتز اسید آمینه روشی دیگر است به این ترتیب که یاخته ها و باکتریها به اسید آمینه نیاز دارند به دلیل اینکه درساختمان پلی پپتیدها ۲۰ اسید آمینه باید مورد استفاده قرار گیرند. اگریک اسید آمینه نیاید آن پروتئین کارایی لازم را ندارد. ازجمله این اسید آمینه ها اسید آمینه تریپتوفان است . E coli همواره به اسید آمینه تریپتوفان نیاز دارد اما به مقدار کافی و مورد نیاز و ضروری نیاز دارد و نبایستی اسیدهای آمینه ازجمله تریپتوفان بیش از حد نیاز ساخته شود. اینها حالت همیشه سازنده دارند که این حالت همیشه سازنده های باید قطع شود برای سنتز اسیدهای آمینه مثل اسید آمینه تریپتوفان نیاز به ۵ تا ژن است. آنزیم هایی مثل آنترانیلات سنتتاز که زن رمز کننده اش ژن E است. آنزیم دیگر آنزیم فسفریل ریبوزیل آنترونیلات سنتتاز است که ژن رمز کننده اش ژن D است. آنزیم دیگر آنزیم اندول گلیسرول فسفات سنتتاز است که ژن رمز کننده اش ژن C است و نهایتاً ژن های A و B رمز کننده آنزیم تریپتوفان سنتتاز را ایجاد می کند. این ۵ تا ژن هم همانند ژن های اوپرون لاکتوز دارای پرومور اوپرون تریپتوفان هستند و باز مانند اوپرون لاکتوز این رشته ژنی بوسیله ژن تنظیم کننده کنترل و تنظیم می شود. این ژن تنظیم کننده ماده ای را سنتز می کند به نام ماده ریگلاتوریا ماده تنظیم کننده که حالت همیشه سازنده دارد. این ماده تنظیم کننده در حالت عادی که باکتری به تریپتوفان نیاز دارد و مورد استفاده قرار می دهد آزاد است . این ماده تنظیم کننده فعالیتش موقعی متوقف می شود که تریپتوفان بیش از نیاز یاخته ساخته شده و حضور دارد دراین حالت تریپتوفان می آید به این ماده تنظیم کننده وصل می شود و باعث می شود که این ماده تنظیم کننده به نحوی تغییر کند که ویژگی چسبیدن به پروموتور اوپراتور ژن های سنتز تریپتوفان را پیدا کند ، دراین حالت که تریپتوفان به آن چسبیده به پروموتور می چسبد و مانع از اتصال آنزیم RNA پلی مراز وابسته به DNA به ژن های سنتز کننده تریپتوفان  می شود درنتیجه مسیرسنتز تریپتوفان بسته می شود و دیگر تریپتوفان ساخته نمی شود تا وقتی که تریپتوفان میزانش کم شود و به ماده تنظیم کنند وصل نشود.

مکانیسم تنظیمی دیگر ، مکانیسم تنظیم سرکوبی کاتابولیک است :

دراین مکانیسم هم باکتری E coli ازهوشمندی خاصی برخوردارا ست. اگر  E coli را درمحیطی کشت دهیم که گلوکز و لاکتوز است ، باکتری ابتدا از گلوکز که استفاده از آن راحتتر است استفاده می کند و تا زمانی که گلوکز درمحیط است آنزیم های مربوط به مصرف لاکتوز را مصرف نمی کند. درصورتیکه براساس مکانیسم اوپرون لاکتوز تولید کند . علت : حتی دیده شده در موتانتهایی که اوپرون لاکتوز همیشه کار می کند باز هم در حضور گلوکز، لاکتوز را کمتر مصرف می کند ، علت این است که وقتی گلوکز درمحیط است مانع از تولید آنزیم آدنیلات سیکلاز می شود که آنزیم آدنیلات سیکلاز را در یاخته ها باعث تولید CAMP می شود.

CAMP اگر درمحیط باشد با ماده ای به نام Catabolic Activator Protein (CAP) کمپلکسی را می سازد که این مجموعه مشوق راه اندازی اوپرون لاکتوز است و تحریک کننده اوپرون لاکتوز است و باعث تسهیل اتصال آنزیم RNA پلی مراز وابسته به DNA به پروموتور اوپرون لاکتوز می شود ، بنابراین ژن های اوپرون لاکتوز ساخته می شود اما درحضور گلوکز و لاکتوز، اگر گلوکز درمحیط باشد باعث کاهش آنزیم آدنیلات سیکلاز می شود و وقتی کاهش یافت میزان تولید CAMP کم می شود و درنتیجه کمپلکس CAMP+ CAP هم کمتر تولید می شود و حالت تشویقی کم شده و فعالیت اوپرون لاکتوز کم می شود.

کاهش مشوق              کاهش کمپلکس       کاهش CAMP       کاهش آنزیم            گلوکز

اپرون لاکتوز              کاهش فعالیت اوپرون لاکتوز

مکانیسم تنظیمی بعدی مکانیسم تنظیمی درشرایط سخت یا تنظیم بی پروا یا شرایط سخت

وقتی باکتری دریک شرایط غذایی است که اسید آمینه وجود ندارد جوری ترکیبات یاخته ای را تنظیم می کند که حداقل آسیب به باکتری برسد و مدت زیادی زنده بماند. دراین شرایط ۲ تا ماده حاوی فسفات به نام گوانوزین َ ۳ دی فسفات َ۵ دی فسفات PPGPP   و گوانوزین َ۳ دی فسفات َ۵ تری فسفات PPP G PP دریاخته دراین شرایط سخت افزایش می یابد وقتی این ماده افزایش یافت جلوی فعالیت بسیاری ازآنزیم ها گرفته شده و سنتز پروتئین کاهش و رونوشت برداری کاهش می یابد و باکتری سعی می کند تعادلی بین مصرف و مواد مورد نیاز موجود ایجاد کند. باکتری های اسپورزا دراین شرایط سخت شروع به هاگ گذاری می کنند و این دو ماده در اسپورزایی هم تولید می شوند.

مکانیسم تنظیمی بعدی مکانیسم تنظیمی فعالیت های آنزیمی است . دو روش برای این مکانیسم است :

  • مکانیسم تنظیمی فیدبک یا برگشتی که برای تولید اسیدآمینه ای مثل ایزولوسین از ترئونین ۵ مرحله با دخالت ۵ آنزیم باید انجام شود. وقتی که این ۵ آنزیم در ۵ مرحله باعث شد که ترئونین به ایزولوسین تبدیل شود و ایزولوسین به میزان کافی تولید شد می آید روی آنزیم اول که ترئولین دِ آمنیاز است اثر کرده و مانع از فعالیت این آنزیم شده و با خاموش شدن این آنزیم، آنزیم های دیگر هم خاموش می شوند. این نوع ممانعت را ممانعت آنزیمی آلوستریک می گویند.
  • آنتی متابولیت، ممانعت آنزیمی دیگر در واقع بین سوبسترا و یک ماده رقابتی مشابه برای اتصال به جایگاه کاتالیتیک آنزیم رقابت پیش می آید و اگر ماده ممانعت کننده میزانش زیاد باشد جایگاه کاتالیتیک آنزیم را پر کرده و باعث می شود که آنزیم روی سوبسترای اصلی تأثیر نگذارد. برخی از آنتی بیوتیکها مثل سولفانامید ها ازاین روش و با این مکانیسم باعث مرگ باکتری می شوند. بین سولفانامید و پاراآمینوبنزوئیک اسید PABA مشابهت ساختمانی است وقتی که سولفانامید را مصرف می کنیم به صورت رقابتی به جای PABA می نشیند و مانع از تأثیر آنزیم روی PABA و عدم تولید اسید نوکلئیک می شود که مورد نیاز باکتری است و باکتری به دلیل عدم سنتز اسید نوکلئیک می میرد . که این سولفانامید را آنتی متابولیت می گویند.

DNA Sequencing

یکی از روش های بسیار مهم در روش مولکولی و ژنتیکی تعیین توالی و ترادف بازهای نوکلئوتیدی است . روشهای مختلفی برای DNA sequencing کارشده است.

اولین روش ماکسام- گیلبرت Maxam- Gilbert است. دراین روش نیاز است که تعداد زیادی ازآن قطعه DNA  ی که سکانس کنیم داشته باشیم که با توجه به اینکه روش PCR ابداع شده است این کار را براحتی می توانیم انجام دهیم. قبلاً که PCR نبود این آقایان با روش استخارج این کار را انجام می دادند.

روش کار ماکسام – گیلبرت : اولین مرحله برای اینکه قطعه مورد نظر را به میزان زیاد سکانس کنیم این است که فسفر انتهای َ۵ را نشان دار کنیم برای اینکار فسفر اصلی را برداشته که با یک فسفاتاز انجام می دهند. بعد از برداشتن این فسفر طبیعی یک فسفر نشان دار یا به عبارتی دیگر رادیواکتیو را جایگزین می کنند که این کار بوسیله ATP که فسفرش رادیواکتیو است و آنزیم ATP Kinase (ATP کیناز) انجام می شود. بوسیله آنزیم ATP کیناز و ATP نشان دار می آیند به جای فسفر برداشته شده درانتهای َ۵ این فسفر نشان دار قرار می دهند ، بنابراین در دو انتهای َ۵ فسفر نشان دار را قرار می دهیم و می شناسیم. درمرحله بعد این قطعه را به مقدار زیاد داریم با یک آنزیم تعیین حدودی (RE) می بریم ، بنابراین قطعات مختلفی ازآن قطعه اصلی ایجاد می شود ، این قطعات مختلف را در روی ژل برده و جدا می کنیم. بعد عمل سکانس کردن را در روی هرقطعه به صورت جداگانه انجام می دهیم و درنهایت اینها را در کنار هم می گذاریم تا سکانس کل قطعه بدست بیاید. مرحله بعد این است که قطعات را ازهم جدا می کنیم. برای سکانس کردن به روش ماکسام – گیلبرت این قطعات را در ۴ تا لوله می ریزیم. برای اینکه شرایط این ۴ لوله با هم متفاوت شوند می آییم به هرلوله ماده یا مواد شیمیایی خاص اضافه می کنیم. تا این ماده یا مواد شیمیایی DNA را دریکی از این بازها و درمحل یکی از بازهای C,T,A و یا G بشکند. دراین لوله های چهارگانه چه موادی می ریزیم؟

دریکی از لوله ها در PH=2 اسید فورمیک و پی پیریدین اضافه می کنیم دراین لوله قطعه ما درمحل بازهای پورینی یعنی A و G می شکند.

اگر به جای اسید فورمیک از دی متیل سولفات (DMS) واکنش اختصاصی تر می شود و قطعه ما را درمحل گوانین می شکند. اگر به لوله سوم هیدرازین و پی پیریدین اضافه کنیم دراین لوله ها قطعه های ما درمحل باز تیمین می شکند و درلوله چهارم هیدرازین، پی پیریدین و نمک طعام (Nacl) اضافه کنیم قطعه DNA ما در محل سیتوزین می شکند.

چون ازمواد شیمیایی استفاده می کنیم به روش ماکسام- گیلبرت روش شیمیایی سکانس کردن هم می گویند. چه اتفاقی دراین لوله ها می افتد ؟

 

فرض کنید قطعه زیر در لوله های چهارگانه وجود دارد ، GCTAGTCGAC  P

 

 

       ۱                      ۲                  ۳                      ۴  

 

پی پیریدین              پی پیریدین            پی پیریدین               پی پیریدین

هیدرازین                  هیدرازین            دی متیل سولفات        اسید فورمیک

نمک طعام

      A                   G                    T                     C   

قبل از تفسیر به دو نکته توجه کنید :

  • شکست یا تخریب باند به صورت نسبی انجام می شود.
  • بریده شدن یا شکست درمحل قبل از باز صورت می گیرد (پشت باز قطع می شود و خود باز در قطعه مورد نظر وجود ندارد)

در لوله اول قطعات زیر را خواهیم داشت. قطعاتی مهم هستند که فسفرنشان دار داشته باشند.

در لوله دوم قطعات زیر را خواهیم داشت :

در لوله سوم قطعات زیر را خواهیم داشت :

در لوله چهارم قطعات زیر را خواهیم داشت :

بعد از انجام این کار لوله ها را الکتروفورز می کنیم . معمولاً الکتروفورز مورد استفاده برای سکانس کردن الکتروفورز عمودی و بزرگ است ( ۵ تا ۶ برابر بزرگتر از SDS-PAGE) . در دستگاه مربوط به سکانس کردن الکتروفورز می کنیم . ژل را بعد از الکتروفورز در می آوریم ( کاری است بسیار مشکل) روی ژل را در تاریک خانه فیلم عکاسی یا رادیولوژی می گذاریم. فسفر نشان دار که رادیواکتیو است اشعهX ساطع می کند و تصویر این قطعات روی فیلم رادیولوژی می افتد به این حالت Auto Radiology  می گویند. بعد از یک تا دو ساعت فیلم را ظاهر کرده و فیلم را می خوانیم.

۲- روش سانجر Sanger  : این روش را آقای سانجر ابداع کردند و جایزه نوبل گرفتند. ایشان با یک تغییر به نظر ساده کار بزرگی را انجام دادند، به این ترتیب که آمدند در مولکول DNA به جای قند دزاکسی ریبوز، از قند ددزاکسی ریبوز، استفاده کردند. این تغییر کوچک (حذف اکسیژن در کربن َ ۳ قند) باعث می شود که بازبعدی به این قند متصل نشود و سنتز متوقف شود.

باز      O     فسفر                                   باز      O        فسفر

                                          OH    H                                         H      H  

ددزاکسی ریبوز                                           دزاکسی ریبوز

در روش سانجر ما از عمل تکثیری برای تعیین توالی استفاده می کنیم . به نوعی روش PCR است به همین دلیل نیاز به پرایمر و آنزیم DNA پلی مراز داریم . بنابراین یک پرایمر طراحی می کنیم برای ابتدای قطعه ای که می خواهیم سکانس کنیم. باز چهارلوله انتخاب می کنیم و درداخل این ۴ لوله مقداری از آن قطعه که می خواهیم سکانس کنیم می ریزیم. بعد پرایمر، ، آنزیم DNA پلی مراز، مقدار مساوی از باز های طبیعی دزاکسی تیمیدین تری فسفات dATP, dGTP,dCTP ,dTTP  اضافه می کنیم . درهمه این چهار لوله تمام این مواد را داریم به عنوان مثال قطعه زیر را می خواهیم سکانس کنیم :

GCACTGCACTCGATCG

این قطعه را درهر چهار لوله می ریزیم. تا اینجا تمام مواد ۴ لوله با هم یکی بود حالا باید تفاوتها را ایجاد کنیم تا سکانس گیری کنیم. در لوله شماره ۱ که می خواهیم A جدا کنیم علاوه بر مواد مشترک باز غیرطبیعی ddATP  (ددزاکسی آدنین تری فسفات که در کربنَ۳ به جای H, OH دارد) به لوله دوم ddGTP، به لوله سوم ddCTP ، و بالاخره به لوله چهارم ddTTP اضافه می کنیم. ثبت باز طبیعی به باز غیر طبیعی یک به ده است . بنابراین سنتز به صورت نسبی انجام می شود. پرایمر ما دراین حالت CGTG  است که فسفر آن نشان دار شده است :

در لوله ها چه اتفاقی می افتد و چه قطعاتی انتظار داریم به وجود بیاید؟

۴                      ۳                      ۲                 ۱

            A               G                C                   T

 

 

قطعه مورد نظر از DNA

موادی که درهمه لوله ها مشترک است               پرایمر

آنزیم DNA پلی مراز

مقدار مساوی از باز های طبیعیdTTP  ؛ dATP ؛ dGTP ؛ dCTP

  قطعات غیر مشترک ddATP           ddGTP             ddCTP          dd TTP                              

رشته مکمل DNA اصلی که سنتز می شود : CGTGACGTGAGCTAGC

در لوله اول قطعاتی که سنتز می شوند عبارتند از : در لوله اول وقتی باز غیر طبیعی ddATP جایگزین می شود چون بر روی کربن َ ۳ این باز O وجود ندارد و تنها H است باز بعدی به آن متصل نمی شود بنابراین در جائیکه A وجود دارد باز بعدی به آن متصل نمی شود بنابراین قطعات زیر مشاهده می شود:

 

در لوله شماره ۲ که ما باز غیرطبیعی ddGTP ریختیم قطعات زیر را خواهیم داشت:

در لوله شماره ۳ که ما باز غیر طبیعی ddCTP ریختیم قطعات زیر را خواهیم داشت:

در لوله شماره ۴ که ما باز غیرطبیعی ddTTP ریختیم قطعات زیر را خواهیم داشت:

مثل روش قبل روی ژل پلی آکریلامید الکتروفورز می کنیم . ۴ تا گوده داریم و بعداً اتورادیوگرافی می کنیم مثل روش قبلی تصویر ایجاد می شود و تصاویر را مشاهده می کنیم.

۳- روش اتومات Automate : اساس این روش همانند روش سانجر است. تنها تفاوت این روش استفاده از چهارنوع پرایمر می باشد که به چهارگروه فلورسانت مختلف متصل می باشند.

در ۴ لوله آزمایش هرکدام ازچهار نوع مختلف پرایمر را با یکی از انواع چهارگانه دی دزاکسی نوکلئوتیدها ddT ، ddA ، ddC و ddG در داخل یک لوله اضافه می کنند. درنتیجه هنگامی که ژل را در برابر نور U.V قرار بگیرد هرکدام از این پرایمرها با رنگی متفاوت مشخص می شود. پس از پایان عمل محتویات چهارلوله را با هم مخلوط کرده و دریک ستون ژل الکتروفورز قرار می دهند و الکتروفورز می نمایند.پس از پایان کار ژل را در یک دستگاه اسپکتوفتومتر اتوماتیک متصل به کامپیوتر قرار می دهند، دستگاه اسپکتوفتومتر رنگ فلورسانس را تعیین و به کامپیوتر منتقل می کند و کامپیوتر با تفسیر رنگ حاصل از اسپکتوفتومتری توالی مورد نظر را تعیین می کند. در سیستم های مدرن تر از این روش حتی ژل نیز یکبار مصرف نمی باشد بلکه یک ژل ثابت بر روی اسپکتوفتومتر نصب شده است . مخلوط قطعات از بالای ژل تعریف می شود و به ترتیب که ازمقابل اسپکتوفتومتر عبور می کنند توالی آنها بوسیله کامپیوتر ثبت می شوند.

 

ضدعفونی کننده ها و روش های ضدعفونی :

  • فیزیکی
  • شیمیایی
  • مکانیکی (Mechanical) بوسیله فیلتراسیون فیلترها بعلت سایز صافیها ذرات کوچکتر را می گیرند و محلول را استریل می کند .

روش مکانیکی:

فیلترهای مایع و هوایی

روش فیزیکی :

اصطلاحات :

باکتریواستاتیک ، ماده ضد عفونی که فقط باعث توقف رشد می شود.

باکتریوسیدال : ماده ضدعفونی که باعث مرگ باکتری درمحیط مایع می شود.

پاستوریزیشن : باکتری ها باقی مانده اند ولی غیرفعال و تعداد آنها کم است.

(strilieation) استریزاسیون : ازبین رفتن کامل باکتری ها

A septic:

Anti septic:

ضدعفونی جانداران

Disinfectants  ضد عفونی بی جان ها )

این سه بیشتر روش های ضدعفونی شیمیایی هستند.

 

 

روش های فیزیکی :

گرمای مرطوب

گرمای خشک

اتوکلاو مهم ترین وسیله ضد عفونی محیط ها است که توسط حرارت مرطوب می باشد . oven ها یا فورها حرارت خشک ایجاد می کنند برای ضد عفونی.

Filtration گاهی شامل مکانیکی ها، گاهی شامل فیزیکی ها می شود.

Rediation اشعه های یون زا و اشعه های غیریون زا

اشعه های یون زا x-rays, gamna rays ،  ،

مکانیسم باعث شکاف در DNA و تغییر ماهیت پرتئین ها

،  کمتر استفاده می شوند ، گاما و X بیشتر استفاده می شوند که کمتر از ۱/۰ نانومتر طول موج دارند پلیت ها و سرنگ ها توسط اشعه گاما ضدعفونی می شوند. درصنعت از کبالت برای ضدعفونی استفاده می شود. بطور کلی این اشعه ها باعث ایجاد رادیکال آزاد می شوند. آب را باردارمی کنند رادیکال هایی ازآب تولید می کنند که بعنوان ضدعفونی کننده بکار می روند.

نوع بعدی، امواج ماوراء صوت هستند. (Sonicator) توسط قراردادن یک الکترود در سوسپانسیون حاوی باکتری که گرما تولید می شود در نتیجه ظرف را داخل یخ می گذارند. خرد کردن دیواره باکتری ها ، قارچ ها، انگل ها، ایجاد تعلیق پادتنی سونیکه ، خردکردن سنگ های کلیه و مثانه و پادتن هایی که به صورت حساس می باشند به این روش انجام می پذیرد.

مکانیسم امواج : ایجاد حباب در نتیجه با ترکیدن ساختمان باکتری را نابود می کنند و باعث نابودی باکتری و مرگ آنها می شود.

روش بعدی فیزیکی، خشک کردن است باکتری ها برای رشد نیاز به رطوبت دارند.

روش بعدی فیزیکی انجماد (freezing ) است بعلت ایجاد کریستال های یخ صدمه به دیواره باکتری.

یکی ازراه های نگهداری نمونه باکتری ازلیوفیلیزه کردن است. دراین روش آب از باکتری گرفته می شود و دراثر انجماد کریستال های یخ بوجود نمی آید و درمحیط خشک فریزه می شود. شیر خشک و گلیسیرین ژلاتین، گلوکز هم برای بهتر نگه داشتن استفاده می شود( استفاده از گلیسیرین از   تا ۵ %)

حرارت: در اپتیموم حرارت باکتری ها بهتر رشد می کنند در نتیجه حرارت باید برای ضد عفونی بیشتر باشد . اپتیموم در باکتری های مختلف متفاوت است .

۳۷  درجه M tuberculosis 

۳۸ درجه   M  Bovis      

۴۹-۴۱    درجه   M   Avium

در حرارت مرطوب توسط اتوکلاو B stearathermaphilic به عنوان مارکر عمل می کند.این باکتری ها مارکر  هستند بنابراین اگر در انتهای عمل اتوکلاو این باکتری از بین رفته باشد یعنی همه باکتریها از بین رفته اند چون میزان تحمل این باکتری بسیار زیاد است . درمورد نور هم همین طور.

حرارت خشک توسط نور : B subtilis  به عنوان مارکر عمل می کند.

اگر بخواهیم اسپورها و هاگ هم از بین برود تا ۲۰ دقیقه اتوکلاو را انجام می دهند.

 

روش های مکانیکی :

اشعه               یون زا (x, y  ،     )

غیریون زا ( uv)

 

حرارت            خشک : فور

مرطوب : اتوکلاو

روش های شیمیایی : باعث از بین رفتن پروتئین ها، خردکردن دیواره ها، بصورت رقابتی عمل می کنند.

(savlou  (cetrimide, stavlen)

دترجنت های  غیریونی : ازجمله تویین ۴۰- ۸۰ گاهی برای رشد بیشتر استفاده می شود . از فراورده های مثل الکل، فنل و اسیدهای چرب با وزن  مولکولی بالا که خاصیت پاک کنندگی سطح دارند ولی خاصیت میکروب کشی آنها پائین است.

دترجنت های آمفولیتیک :

پاک کننده های سطحی وجز مواد شوینده  هستند که ضد عفونی کننده ضعیف هستند اما کاهش دهنده کشش سطحی هستند. مثل SDS سدیم دو دسیل سولفات

۸-الکل ها : اتانول و پروپانول :

به صورت مطلق و رقیق شده با افزایش وزن مولکولی خاصیت ضدعفونی بیشتری پیدا می کنند و برای نفوذ به یاخته نیاز به آب دارند.

گلیسرول برای نگه داری فراورده های بیولوژیک مثل واکسن و دارو استفاده می شود (گلیسرول فاقد خاصیت اسپور کشی است)

برای افزایش خاصیت میکروب کشی گلیسرول آن را با ترکیبات ید ترکیب می کنند. (تنتورید)

تنتورید : ۵/۱۴% ید، ۲% ید در پتاسیم و ۷۰ % الکل است.

۹- آلدئید ها : مثل فرمالدئید به صورت مایع گاهی بصورت گاز بخصوص برای ضدعفونی فضاها استفاده می شود.

۱۰- ترکیبات فنلی :

استحلاف های فنلی خاصیت میکروب کشی بیشتر دارند.

خاصیت اسپورکشی هم دارند.

زمان های مساوی ازهررقتی کشت می دهند  : در ۳۷ درجه : زمان انکوباسیون متفاوت در آزمایشگاه ها

حاصل تقسیم رقتی از ماده ضدعفونی کننده که هنوز می تواند باکتری را درزمان مشخص استریل کند در رقتی از فنل که درهمان زمان می تواند ماده را ضد عفونی کند ( همان کار را انجام دهد) ضریب فنلی بیشتر باشد بهتر است.

ایجاد آلرژی و بدن میزبان ، سمیت، ماندگاری درمحیط هم مهم هستند و تنهای ضریب فنلی مهم نیست.

Chickmartiu : به حالت طبیعی نزدیک تر است

به مقدار ثابت از مدفوع راهم به محیط ها اضافه می کند که درحضور ممانعت کننده ها ماده ضد عفونی چگونه عمل می کند.

ضریب سمیت : بالاترین رقت که سبب مرگ بافت می شود.

بالاترین رقت که سبب مرگ باکتری می شود.


behtarinalborz.ir
goftardarmanionline.ir
googleimage.ir
hamejaa.ir
medu-karaj.ir
siavashataee.ir
slpnews.ir
autismonline.ir
avalinkaraj.ir
behtarin-entekhab-karaj-siavashataee.ir
behtarinkaraj.ir
goftardarmanikaraj.ir
goftareravan.ir
google-map.ir
googlegame.ir
googlemovies.ir
karaj-medu.ir
kardarmanialborz.ir
kardarmanikaraj.ir
loknatclinic.ir
loknatshekan.ir
neurofeedbackalborz.ir
otalborz.ir
otkaraj.ir
pff-rhs.ir
pooyesh-dar-goftardarmani-karaj.ir
pooyesh-dar-kardarmani-karaj.ir
siavash-ataee.ir
slpkaraj.ir
slponline.ir
speech-therapy.ir
tjhvnvlhkd.ir

درباره : گفتار توان گستر

دلایل استفاده از لکنت شکن دیجیتال توسط درمانگردر سایر کشورها: یک- داشتن دانش استفاده از آن توسط درمانگر ، زیرا اطلاعات پایه ای از آکوستیک ، الکترونیک ، کامپیوتر ، روانشناسی به انضمام آسیب شناسی گفتار و زبان را می طلبد . دو- داشتن فرهنگ استفاده از آن توسط درمانجو، زیرا بکار بردن دستگاه در طول مدت شش ماه تا یکسال هر روز و هرروز بدور از تحت تاثیر قرار گرفتن توسط اطرافیان و دوستانی که توان مالی تهیه آنرا ندارند ، تا حصول نیجه نهایی الزامیست . لازم به ذکر است که قیمت لکنت شکن در حال حاضربین دوازده تا شانزده میلیون تومان است ، لذا به دلیل محدودیت مالی شرکت تهیه کننده ، این دستگاه به صورت استیجاری و امانت در طول مدت درمان ، پس از ارزیابی اولیه دراختیار فرد متقاضی قرار داده خواهد شد . سه- داشتن صرفه اقتصادی، نسبت به حضور در جلسات درمانی هفتگی . چهار - دنبال کردن پروتکل درمانی هفتگی توسط درمانجو، بنا به صلاحدید درمانگر در طول دوره درمان . پنجم - الزام به ارسال روزمره نتایج درمان توسط درمانجو به صورت فایل صوتی از طریق پیام رسانهای جمعی ، حتی پس از بهبود کامل به مدت یکسال به منظور جلوگیری از پدیده بازگشت لکنت زبان the model speaker, rather than providing a non¬distorted motor template for the person who stutters to match, instead provides a pacing or rhythmic one (Johnson & Rosen, 1937); a perspective that would appear consistent with Kalinowski et al’s findings. It is worth noting that all of those mentioned above have also been levelled at the fluency enhancing properties of delayed auditory feedback (DAF), which we discuss below. (The relationship between choral speech and DAF is an important one, and we return to this with regard to therapy in chapter 14.) Shadowed speech This is a type of cued speech which is very closely related to choral and unison versions. Technically, shadowed speech occurs where there is a slight delay between the speech of the model speaker and the person who stutters, as opposed to the simultaneous output produced during unison and choral speech. The difference is that while with choral speech the speaker knows exactly what the model speaker is going to say, shadowed speech can be used to follow the novel speech of the model speaker. Like choral/unison speech, shadowing can produce dramatic results (Cherry & Sayers, 1956; Kelham & McHale, 1966), but like them the gains in fluency tend to be lost once the stimulus of the model speaker has ended. Because of this, the use of choral or shadowed speech is now rare, and usually confined only to moments in therapy or assessment, where it is considered important to have the client experience a moment of fluency, albeit in the knowledge that this method of producing it will not provide any basis for sustainable improvement. What is interesting from our present perspective, however, is the potential relationship between shadowed speech and delayed auditory feedback. As we will see in chapter 16, the fluency enhancing effect of shadowed and choral speech has been put to use in devices which use DAF and frequency auditory feedback (FAF) to approximate the effects of speaking alongside other speakers. Delayed auditory feedback It is now over 40 years since Goldiamond and colleagues first stumbled on the potential fluency enhancing effects of delayed auditory feedback (Flanagan, Goldiamond, & Azrin, 1958, 1959; Goldiamond, 1965). Findings from the earliest experiments centred around the vicarious discovery that some people who stuttered experienced improved fluency when they put on headphones and heard their speech played back to them with a slight time delay. (Some readers may already have experienced DAF as an echo effect when speaking on a poor transcontinental telephone line.) Commonly, DAF also results in reduced fluency in nonstuttering speakers (Fukawa, Yoshioka, Ozawa, & Yoshida, 1988; Stuart, Kalinowski, Rastatter, & Lynch, 2002), although Fukawa et al. observed that people who stutter were significantly more likely to be affected by DAF than nonstutterers, and that male nonstutterers were more susceptible to the effect than females. Most noticeably, Goldiamond (1965) found a tendency for speakers to slow their rate of speech in an effort to counteract the disruptive influences of the delayed feedback. Particularly, at around 250 ms delay[1] (0.25 of a second) a prolonged speech pattern was produced, where vowels became disproportionately more stretched than con-sonants. The further finding that the extent of the prolonged speech could be controlled by altering the delay times lead to the development of a number of “prolonged speech” programs which used DAF in a systematic way to elicit fluent speech. (See chapter 12 as to how prolonged speech programs have developed.) During the early stages of therapy, DAF was set to encourage excessive prolongation, usually around 250 ms. When clients were able to demonstrate 100 percent fluency in their speech at this delay setting, the next stepwise decrease in DAF (usually in 50 ms increments) was introduced to encourage a slightly faster rate of speech. Again, the client learned to control fluency using decreased prolongation associated with the reduced DAF. The procedure was then repeated at incrementally reduced delay levels, with clients having to demonstrate completely fluent speech at each one before progressing to the next decreased DAF setting. Eventually, the client reached the point where he was able to maintain fluency without any delay in auditory feedback (e.g., Curlee & Perkins, 1969, 1973). At this time it was thought that the fluency enhancing effects of DAF could be explained simply as by¬products of the slower rate speech that it produced. During the mid-1970s and through the 1980s there was a lull in DAF research as clinicians looked to alternative ways of slowing speech for therapy. It was not until the early 1990s when a resurgence of interest occurred, largely driven by findings that increased fluency could indeed result under DAF at normal and even fast rates of speech (e.g., Stuart & Kalinowski, 1996). This finding has led to a new generation of clinicians and researchers becoming interested in DAF as a treatment option for stuttering. We examine the more recent applications in relation to therapy elsewhere (see chapter 14). Aside from the therapeutic implications, the early findings that DAF could enhance fluency for at least some people who stutter led to a number of theories of stuttering, based on the assumption that timing perception is disturbed. Summary There is a range of evidence that points to the notion that stuttering is associ¬ated with disrupted auditory processing, although the exact nature of this disruption remains obscure. Shadowed speech can produce high levels of fluency, but this may have little to do with any timing misperception induced by a faulty processing system; we know that unison speech similarly produces high levels of fluency with no delay. We also know that DAF and FAF can have dramatic fluency enhancing effects for some people who stutter, yet others remain DAF and FAF negative, for reasons which are currently unknown. Also, and as we see in chapter 14, there are reports from some people who stutter that the effects of altered feedback can wear off over time. Perhaps these findings suggest that distraction may play as big a part in inducing fluency as correcting any misperception of a disrupted auditory timing processing system? As we see in chapter 2, brain studies have shown differences in functioning between people who stutter and control group speakers across linguistic and motor areas. The dichotic listening procedure provides one testable method of determining hemispheric dominance for lin¬guistic decoding, and findings from such studies, though far from definitive, lend tentative support to the idea that auditory processing too might be a product of the right hemisphere, at least in some people who stutter. One of the biggest issues faced is that auditory processing is just one part of the communication chain and does not occur in a vacuum. Both production and perception theories must allow for the fact that one is affected by the other. This can lead to a chicken and egg situation, as brought into sharp focus in the criticism of Harrington’s theory of linguistic rhythm and auditory feedback: it can be almost impossible to determine what is cause and what is effect. Key points • The deaf population is the only one in which stuttering is underrepresented. • Stuttered speech may be improved under a number of conditions which serve to disrupt or alter auditory feedback, such as masking, delayed auditory feedback (DAF), frequency altered feedback (FAF), choral and unison speech. • People who stutter may be more reliant on auditory feedback than those who do not stutter. • The Buency enhancing effects of altered feedback devices may work by convincing the brain that the speaker© speech is actually the product of an external speech source. • There is evidence that, like processing for speech production, audi¬tory processing for speech may be a product of right hemisphere processing amongst older children and adults who stutter. • It has been argued that stuttering might result due to misperception of the timing of stressed vowels in speech (Harrington, 1988). • It is possible that auditory processing anomalies may in fact merely represent Cknock-onCeffects of a dehcit that are in essence produc¬tion based. Further reading Harrington, J. (1988). Stuttering, delayed auditory feedback and linguistic rhythm. Journal of Speech and Hearing Research, 31, 36-47. Aside from the theoretical implications, this thought-provoking paper provides a well- explained introduction into the links between perception and production aspects of speech processing in stuttering. Kalinowski, J., Armson, J., Roland-Mieszowski, M., & Stuart, A. (1993). Effects of alterations in auditory feedback and speech rate on stuttering frequency. Language and Speech, 36, 1-16. As with the selected reading list from chapter 14 which discusses auditory feedback from a therapeutic perspective, there is a wide range of Kalinowski and colleagues’ work that could have been included here. This one is an early but influential article on the discovery that altered feedback could reduce stuttering, without invoking a slowed speech rate. Rosenfield, D.B., & Jerger, J. (1984). Stuttering and auditory function. In R. Curlee and W. H. Perkins (Eds.), The nature and treatment of stuttering: New directions (pp. 73-88). San Diego, CA: College Hill Press. Much of the work on stuttering and auditory function was undertaken in the 1970s and early 1980s. Despite its age, this is still a very good source for earlier material on the subject of auditory processing and covers a lot of ground. There is currently no similar but more recent publication on the subject سایتهای مرتبط http://Siavashataee.com Goftardarmani.com http://Loknatzaban.org Vazir.org avalinkaraj.ir behtarin-entekhab-karaj-siavashataee.ir behtarinalborz.ir behtarinealborz.ir behtarinekaraj.ir behtarinkaraj.ir entekhabe1400.ir address-goftardarmani-karaj.ir siavash-ataee.ir goftardarmanikaraj.ir goftardarmanionline.ir goftareravan.ir google-map.ir googlegame.ir googleimage.ir googlemovies.ir googleonline.ir hamejaa.ir karaj-medu.ir kardarmanialborz.ir kardarmanikaraj.ir loknatclinic.ir loknatshekan.ir medu-karaj.ir neurofeedbackalborz.ir otalborz.ir otkaraj.ir pff-rhs.ir siavash-ataee.ir siavashataee.download siavashataee.info siavashataee.ir siavashataee.mobi slpkaraj.ir slpnews.ir slponline.ir speech-therapy.ir autismonline.ir

آیا به اینها هم علاقه مند هستید ؟

0 دیدگاه در “تقسیم بندی باکتری ها از نظر انرژی|گفتار توان گستر ۰۹۱۲۱۶۲۳۴۶۳”

دیدگاهتان را بنویسید

تازه های تکنولوژی

ویدیوی برتر هفته